目前由于乳腺癌（BC）診斷臨床工具的單一化，不同體液的液體活檢已成為一種微創(chuàng)診斷策略，它可為早期診斷、積極監(jiān)測(cè)進(jìn)展和預(yù)后復(fù)發(fā)提供腫瘤標(biāo)記物的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。細(xì)胞外囊泡（EV）是直徑為50–1000 nm的納米級(jí)膜結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞釋放到生物液體中。EVs含有蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，它們通過(guò)細(xì)胞間通訊在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)，研究小EV（sEV）的蛋白質(zhì)和miRNA是新的BC生物標(biāo)志物的潛在來(lái)源。本文闡述了sEV分離和表征的新技術(shù)，總結(jié)了用于BC診斷、預(yù)后的sEV蛋白和miRNA生物標(biāo)志物，討論了當(dāng)前sEV生物標(biāo)志物研究的局限性以及未來(lái)的應(yīng)用前景。

重要結(jié)果

1. 在BC液體活檢中sEV作為生物標(biāo)志物來(lái)源的優(yōu)勢(shì)

目前，用于腫瘤診斷和預(yù)后最常見方式是組織活檢。然而，組織活檢很難獲得樣本，并且來(lái)自活檢樣本的腫瘤分子和遺傳信息多為早期檢測(cè)，篩查和監(jiān)測(cè)存在局限性。為了克服傳統(tǒng)生物標(biāo)志物鑒定和驗(yàn)證手段的技術(shù)挑戰(zhàn)，提出了基于體液活檢的分析，其重點(diǎn)是利用循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs），循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA），各類體液（包括血液，尿液和唾液）中的細(xì)胞外囊泡（EVs）作為腫瘤診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的來(lái)源。與組織活檢相比，體液活檢能夠追蹤異質(zhì)性，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，減少疼痛和副作用，并且獲得樣本的過(guò)程更快，更容易。

而在BC體液活檢領(lǐng)域中，許多研究人員已將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向sEV，因?yàn)樗鼈冊(cè)谏矬w液中相對(duì)更豐富，細(xì)胞中的生物含量豐富，且形態(tài)穩(wěn)定。對(duì)于臨床應(yīng)用，第一個(gè)基于sEV的商業(yè)試驗(yàn)ExoDx? 前列腺（IntelliScore）于2017年推出，由FDA批準(zhǔn)，該測(cè)試能夠?qū)⑶傲邢侔┌Y患者的組織活檢采集量減少27%。這表明，來(lái)自體液活檢的sEV為生物標(biāo)志物的開發(fā)開辟了一條新的途徑，可以影響包括BC在內(nèi)的各種癌癥的診斷、預(yù)測(cè)和治療。

2. sEV分離和表征

理想的sEV富集方法簡(jiǎn)單、高通量、快速、成本低、純度高。然而，由于生物樣本的復(fù)雜性和EV的異質(zhì)性，目前的分離方法都不符合這些標(biāo)準(zhǔn)。克服這些障礙的一種可能是結(jié)合兩種或多種分離技術(shù)。例如，據(jù)報(bào)道，與單獨(dú)使用體積排除色譜法(SEC)或超速離心(UC)相比，在BC細(xì)胞系中使用聚乙二醇（PEG）沉淀結(jié)合SEC，可在更短的時(shí)間內(nèi)富集20至200倍高濃度的sEV蛋白。此外，在BC患者的血清中進(jìn)行半個(gè)周期的UC后結(jié)合ExoQuick或Total Exosome Isolation試劑盒，可顯著提高產(chǎn)量，減少耗時(shí)?？傊?，繼續(xù)開發(fā)聯(lián)合分離技術(shù)可能是選擇和分離sEV的可行選擇，這有助于下游分析和臨床應(yīng)用。

從乳腺癌癥（BC）血樣和細(xì)胞系中分離出的sEV可以通過(guò)大小、形態(tài)、濃度和sEV標(biāo)記物來(lái)表征。sEV尺寸和濃度可以通過(guò)納米粒子跟蹤分析（NTA）和單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）進(jìn)行分析。電子顯微鏡（EM）可以根據(jù)大小和形態(tài)對(duì)sEV進(jìn)行分類。納米流式細(xì)胞術(shù)（nFCM）、高靈敏度流式細(xì)胞儀（HSFCM）、高分辨率流式細(xì)胞（hFCM）和熒光活化囊泡分選（FAVS）可以使用各種sEV標(biāo)記物對(duì)sEV進(jìn)行亞群分類。sEV蛋白可以通過(guò)基于質(zhì)譜的分析（包括無(wú)標(biāo)記和基于標(biāo)記的定量）來(lái)分析。為了驗(yàn)證sEV蛋白和肽段標(biāo)記物，可以使用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）、平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）、蛋白質(zhì)印跡（WB）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

3. 在BC診斷、預(yù)后和化療耐藥中sEV蛋白生物標(biāo)志物的作用

從BC患者的細(xì)胞上清液和血液樣本中收集sEV。分離的sEV通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法（如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC–MS/MS）和反相蛋白質(zhì)微陣列（RPPA））進(jìn)行分析，并通過(guò)sEV蛋白質(zhì)檢測(cè)方法（包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和蛋白質(zhì)印跡（WB））進(jìn)行驗(yàn)證。鑒定了BC sEV樣品中的各種上調(diào)或下調(diào)蛋白，可用于BC診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)BC化療耐藥性。

4. 在BC診斷、預(yù)后和化療耐藥中sEV miRNA生物標(biāo)志物的作用

miRNA是長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸的短單鏈非編碼RNA分子，可以通過(guò)直接與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合來(lái)抑制基因功能。使用高通量測(cè)序（NGS）分析研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是sEV中最顯著的RNA種類，并鑒定出593種獨(dú)特的miRNA。在血液中，將miRNA封裝在sEV中可以提供穩(wěn)定的環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞間的遠(yuǎn)距離通信。因此，攜帶釋放到血液中的miRNA的腫瘤衍生sEV可能是疾病診斷、預(yù)后和治療管理的寶貴生物標(biāo)志物資源。

收集BC血漿和細(xì)胞上清液樣本，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）、高通量測(cè)序（NGS）和微陣列分析分析分離的含有miRNA的sEV。BC樣本獨(dú)特的sEV miRNA表達(dá)譜對(duì)BC的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)化療耐藥具有價(jià)值。

結(jié)論

為了提高BC的診斷和預(yù)后，研究人員越來(lái)越關(guān)注體液活檢，因?yàn)槠淝忠u性有限，適合于腫瘤監(jiān)測(cè)。根據(jù)文章描述的證據(jù)，監(jiān)測(cè)sEV衍生蛋白和miRNA的變化對(duì)于BC生物標(biāo)志物翻譯具有巨大的潛力和前景。