寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由韋恩州立大學(xué)Karmanos癌癥研究所在2020年5月7日發(fā)表于Cell Death & Disease（2020IF：8.469，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Xiaohong Mary Zhang教授，研究表明USP10-HDAC6軸在缺乏野生型p53的非小細(xì)胞肺癌中賦予順鉑耐藥性。

研究背景

????????泛素特異性肽酶10（USP10）屬于USP家族。由于其相關(guān)蛋白和底物的多樣性，USP10在癌癥中的作用仍然難以捉摸。先前的研究表明USP10能夠穩(wěn)定腫瘤抑制基因和癌基因。然而，USP10在非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 中的作用的性質(zhì)仍不清楚。

摘要部分

????????通過(guò)分析癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)庫(kù)，作者發(fā)現(xiàn)高水平的USP10與具有突變p53的NSCLC的總體生存率較差相關(guān)，但與野生型p53無(wú)關(guān)。USP10的敲低或藥理學(xué)抑制顯著降低了缺乏野生型p53的肺癌異種移植物的生長(zhǎng)，并使它們對(duì)順鉑敏感。從機(jī)制上講，USP10與致癌蛋白組蛋白去乙?；?（HDAC6）相互作用，去泛素化，并使其穩(wěn)定。此外，將USP10或HDAC6重新表達(dá)到USP10敲低的NSCL CH1299細(xì)胞系中，會(huì)導(dǎo)致其對(duì)順鉑產(chǎn)生抗性。該結(jié)果表明存在“USP10-HDAC6-順鉑耐藥性”軸。在臨床上，作者發(fā)現(xiàn)USP10和HDAC6表達(dá)在一組NSCLC患者樣本中呈正相關(guān)。此外，作者已經(jīng)表明，在接受鉑類(lèi)化療的晚期NSCLC患者中，高水平的USP10 mRNA與較差的總體生存率相關(guān)?？傮w而言，作者的研究表明，USP10可能是預(yù)測(cè)患者對(duì)鉑類(lèi)反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物，靶向USP10可使缺乏野生型p53的肺癌患者對(duì)鉑類(lèi)療法敏感。

研究?jī)?nèi)容

1.USP10與HDAC6相互作用??? ? ?

????????為了研究USP10在肺癌中的作用，作者采用了蛋白質(zhì)純化方法。作者發(fā)現(xiàn)了68個(gè)USP10結(jié)合蛋白。從上述分析中鑒定了一種HDAC6肽。為了進(jìn)一步證實(shí)這種相互作用，作者在H23 NSCLC細(xì)胞系中免疫沉淀了內(nèi)源性HDAC6和USP10。另一方面，抗HDAC6抗體能夠免疫沉淀USP10。這些結(jié)果證實(shí)了內(nèi)源性USP10和HDAC6在肺癌細(xì)胞中相互作用。

????????為了確定USP10是直接還是通過(guò)其他蛋白質(zhì)與HDAC6結(jié)合，純化的GST-USP10和His-HDAC6能夠在無(wú)細(xì)胞條件下通過(guò)GST pull-down試驗(yàn)相互作用，表明USP10和HDAC6之間存在直接相互作用。接下來(lái)，作者映射了HDAC6的哪些域與USP10結(jié)合。HDAC6的兩個(gè)全長(zhǎng)催化域：N端DAC1和中央DAC2與USP10結(jié)合。

研究結(jié)論：USP10與HDAC6之間發(fā)生相互作用。

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2.HDAC6是USP10的新底物? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)只有野生型USP10，而不是催化缺陷突變體（USP10/C424A）在293T的表達(dá)，顯著增加了HDAC6的內(nèi)源性水平，表明USP10的去泛素化酶活性對(duì)于增加HDAC6的蛋白質(zhì)水平是必不可少的。為了驗(yàn)證USP10在調(diào)節(jié)HDAC6蛋白水平中的作用，作者接下來(lái)在不同細(xì)胞中敲低USP10，并觀(guān)察到 HDAC6蛋白在四種NSCLC細(xì)胞系以及兩種卵巢細(xì)胞系中的表達(dá)顯著降低。作者還發(fā)現(xiàn)HDAC6的mRNA水平不受USP10敲低的影響，表明USP10對(duì)HDAC6的調(diào)節(jié)不是通過(guò)轉(zhuǎn)錄。

????????作者隨后探究癌細(xì)胞系中USP10和HDAC6表達(dá)之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDAC6蛋白水平與幾種肺癌細(xì)胞系和卵巢癌細(xì)胞系中的USP10蛋白水平呈強(qiáng)正相關(guān)。為了驗(yàn)證USP10通過(guò)去泛素化并因此穩(wěn)定HDAC6上調(diào)其表達(dá)，作者通過(guò)用蛋白質(zhì)合成抑制劑放線(xiàn)菌酮 (CHX) 處理USP10野生型和USP10敲除MEF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHX處理使HDAC6蛋白水平隨時(shí)間快速下降。類(lèi)似地，與對(duì)照細(xì)胞相比，H23 NSCLC細(xì)胞中USP10的敲低縮短了HDAC6的半衰期。一致地，USP10與其特異性抑制劑 Spautin-1的直接抑制也導(dǎo)致HDAC6的蛋白質(zhì)半衰期顯著縮短。

研究結(jié)論：USP10增加了HDAC6蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

????????與對(duì)照 H23 細(xì)胞相比，USP10的敲低降低了HDAC6蛋白水平，而 MG132（蛋白酶體抑制劑）回補(bǔ)了敲低細(xì)胞中HDAC6的表達(dá)，表明阻斷蛋白酶體降解導(dǎo)致HDAC6積累。接下來(lái)，作者測(cè)試了USP10是否可以去泛素化HDAC6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型USP10顯著降低了293T細(xì)胞中的HDAC6泛素化。為了排除USP10相關(guān)蛋白作為HDAC6的DUB的可能性，使用純化的USP10及其突變體和泛素化HDAC6蛋白作為底物進(jìn)行了體外去泛素化測(cè)定。野生型USP10有效地從HDAC6中去除了多聚泛素鏈。為了進(jìn)一步辨別USP10去除的HDAC6上多聚泛素鏈的連接，作者利用了泛素鏈連接特異性抗體。H1299 細(xì)胞中USP10的敲低顯著增加了HDAC6中K48連接的多聚泛素鏈的存在，作者的結(jié)果證實(shí)了USP10從HDAC6中去除泛素鏈的觀(guān)點(diǎn)，這反過(guò)來(lái)又穩(wěn)定了HDAC6。

????????為了鑒定HDAC6泛素化位點(diǎn)，作者在293T細(xì)胞中共過(guò)表達(dá)HDAC6和泛素，然后用 MG132 處理。泛素化HDAC6被免疫沉淀并在SDS PAGE上解析，泛素化HDAC6條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示HDAC6在三個(gè)賴(lài)氨酸殘基處泛素化：K51、K116 和 K849。與野生型HDAC6相比，K51R、K116R 和 3KR 突變體而非 K849R 突變體的泛素化水平顯著降低，表明K51和K116 是體內(nèi)主要的泛素化位點(diǎn)。

研究結(jié)論：USP10是一種HDAC6去泛素酶，它可以通過(guò)去除HDAC6在特定賴(lài)氨酸殘基（包括K51和K116）上的K48連接的多聚泛素鏈來(lái)延長(zhǎng)HDAC6的穩(wěn)定性。

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3.USP10的敲低或抑制使攜帶突變或無(wú)效p53的NSCLC細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感? ? ?

????????之前的研究表明HDAC6在NSCLC細(xì)胞系中賦予順鉑耐藥性。因?yàn)閁SP10穩(wěn)定HDAC6，作者探究USP10是否通過(guò)HDAC6賦予順鉑耐藥性。作者在NSCLC和卵巢癌細(xì)胞系中去除了USP10，并用載體或順鉑處理它們以通過(guò)MTT測(cè)定檢查細(xì)胞活力。在USP10敲低后，含有無(wú)效突變體-p53的六個(gè)細(xì)胞系對(duì)順鉑敏感，而含有野生型p53的這三個(gè)細(xì)胞系在USP10敲低后，對(duì)順鉑具有抗性。與單獨(dú)的P22077或順鉑處理相比，P22077和順鉑處理的組合顯著降低了細(xì)胞活力。這一結(jié)果證實(shí)了USP10的敲低或抑制使含有無(wú)效或突變p53的肺癌或卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感的觀(guān)點(diǎn)。

????????為了確定p53是否是USP10敲低后順鉑敏感性的決定因素，作者使用了一對(duì)A549對(duì)照和A549-p53敲除細(xì)胞系。USP10的敲低使A549-p53 KO細(xì)胞致敏，但A549對(duì)照細(xì)胞不致敏。該結(jié)果表明在p53缺失背景中選擇性靶向USP10會(huì)使癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感。

研究結(jié)論：USP10的敲低或抑制使攜帶突變或無(wú)效p53的NSCLC細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感。

????????作者接下來(lái)檢查了USP10敲低和順鉑治療對(duì)長(zhǎng)期細(xì)胞存活的影響。為此，作者使用三對(duì)對(duì)照和USP10穩(wěn)定敲低NSCLC細(xì)胞系（H157、H23和H1299）和兩對(duì)對(duì)照和USP10穩(wěn)定敲低卵巢癌細(xì)胞系（SKOV3和ES-2）進(jìn)行了集落形成分析，這些細(xì)胞都含有正?；蛲蛔兊膒53。USP10的穩(wěn)定敲低使所有細(xì)胞系對(duì)順鉑非常敏感。為了確定USP10活性的抑制是否會(huì)達(dá)到與USP10敲低相似的結(jié)果，作者用USP10抑制劑Spautin-1處理三種NSCLC細(xì)胞系，以及用USP10抑制劑P2207714處理H1299。順鉑聯(lián)合USP10抑制劑抑制集落生長(zhǎng)的作用大于單獨(dú)使用順鉑或USP10抑制劑，表明靶向USP10的活性將使NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑敏感。

????????隨后，為了確定USP10敲低誘導(dǎo)的順鉑敏感性增加是否是由于細(xì)胞凋亡，作者檢查了兩種NSCLS細(xì)胞系H157和H23中的PARP-1裂解。正如預(yù)期的那樣，在USP10穩(wěn)定敲除的H157細(xì)胞系中，與對(duì)照敲除的細(xì)胞相比，裂解PARP-1的水平以順鉑劑量依賴(lài)的方式升高了。因此，USP10可能會(huì)降低順鉑敏感性并通過(guò)HDAC6發(fā)揮致癌作用。為此，作者將HDAC6或USP10重新引入到USP10敲低的H1299細(xì)胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP10敲低細(xì)胞中HDAC6或USP10的過(guò)表達(dá)顯著增加了順鉑處理后的細(xì)胞存活率并減少了細(xì)胞凋亡，如裂解的PARP-1水平所示。

研究結(jié)論：存在一個(gè)USP10-HDAC6軸，該軸在決定順鉑敏感性和野生型p53缺失時(shí)USP10的致癌功能方面起著至關(guān)重要的作用。

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4.USP10的敲低或抑制會(huì)降低異種移植物的生長(zhǎng)并使異種移植物對(duì)順鉑敏感? ? ?

????????作者隨后探究在缺乏野生型p53的癌癥中USP10的缺失是否會(huì)減少腫瘤發(fā)生并增加體內(nèi)化學(xué)敏感性。為了研究USP10敲低對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響，作者在免疫缺陷小鼠中接種了四對(duì)對(duì)照和USP10敲低癌細(xì)胞，并測(cè)量了異種移植物隨時(shí)間推移的生長(zhǎng)情況。在測(cè)試的所有四種細(xì)胞系中，USP10的缺失顯著減小了腫瘤大小。一致地，在USP10敲低SKOV3和ES-2異種移植物中，腫瘤重量顯著降低。這些結(jié)果表明USP10的敲低抑制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。然后作者開(kāi)始探究USP10的敲低是否使肺癌異種移植物對(duì)順鉑敏感。USP10的敲除大大減少了異種移植物的生長(zhǎng)，并且與順鉑治療相結(jié)合幾乎完全消除了腫瘤的發(fā)生。

????????此外，作者還觀(guān)察到USP10的敲低顯著降低了 H1299、SKOV3（p53-null）以及 H23、ES-2 和 H157（p53-突變體）的異種移植物生長(zhǎng)，但不會(huì)顯著降低A549（p53-野生型），表明p53是USP10介導(dǎo)的體內(nèi)生長(zhǎng)的決定因素。作者接下來(lái)評(píng)估了USP10抑制劑對(duì)鼠異種移植腫瘤的潛在治療益處。為此，作者使用p53缺陷型NSCL CH1299細(xì)胞系在體內(nèi)測(cè)試了USP10抑制劑P22077。單獨(dú)使用順鉑或P22077的單藥治療導(dǎo)致對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制，而P22077與順鉑組合顯示出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)更為有效的抑制。在所有治療組的任何小鼠中均未觀(guān)察到體重減輕，這表明P22077單獨(dú)或與順鉑組合的劑量對(duì)小鼠無(wú)毒。

研究結(jié)論：敲低或抑制USP10可抑制肺癌和卵巢癌異種移植的生長(zhǎng)，并使異種移植對(duì)免疫缺陷小鼠的順鉑治療敏感。

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5.USP10和HDAC6在肺癌和卵巢癌中均高度表達(dá)；在接受鉑類(lèi)治療的NSCLC患者中，高水平的USP10與較短的總生存期相關(guān)??? ?

????????為了進(jìn)一步驗(yàn)證作者在人類(lèi)癌癥患者樣本中的發(fā)現(xiàn)，作者首先使用數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine 分析了正?；蜻x定癌癥組織中USP10表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，與正常組織相比，USP10的mRNA水平在NSCLC的三種組織學(xué)亞型以及卵巢癌中明顯過(guò)表達(dá)。在上述研究中，作者在17個(gè)肺癌和卵巢癌細(xì)胞系中顯示出USP10和HDAC6之間的強(qiáng)正相關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)這種表達(dá)模式以及臨床組織標(biāo)本中USP10和HDAC6之間的關(guān)系，作者進(jìn)行免疫組織化學(xué) (IHC) 染色以評(píng)估這些患者樣本中的USP10和HDAC6表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常組織相比，癌癥患者樣本中USP10和HDAC6的表達(dá)均顯著增加。

????????接下來(lái)，作者檢查了USP10的水平是否可以預(yù)測(cè)NSCLC患者的鉑類(lèi)反應(yīng)。在42名接受鉑類(lèi)治療的患者隊(duì)列中，USP10的高mRNA水平對(duì)總體生存率產(chǎn)生不利影響?？傮w而言，USP10是一種潛在的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。為了檢查USP10表達(dá)對(duì)p53突變NSCLC患者的影響，作者使用了來(lái)自TCGA的964名患者隊(duì)列。高水平的USP10 mRNA與p53突變體中較低的OS相關(guān)，但與p53野生型隊(duì)列無(wú)關(guān)，這表明USP10是具有p53突變的NSCLC子集中的潛在靶標(biāo)。

研究結(jié)論：在肺癌和卵巢癌患者樣本中，USP10的mRNA和蛋白水平都有所增加；USP10 mRNA水平高與接受鉑金治療的晚期NSCLC患者的總生存率差有關(guān)。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者的研究表明SKP2介導(dǎo)了K63相關(guān)的泛素化和Bcr-Abl的激活，以增強(qiáng)Bcr-Abl信號(hào)傳導(dǎo)。此外， USP10是SKP2的新型DUB，它可能與USP13一起發(fā)揮作用，介導(dǎo)對(duì)抗泛素化和SKP2降解的對(duì)抗作用，從而確保SKP2的高蛋白質(zhì)水平和增強(qiáng)的Bcr-Abl信號(hào)傳導(dǎo)。作者的發(fā)現(xiàn)這為細(xì)胞周期控制的失調(diào)提供了新的見(jiàn)解。本研究還確定了以USP10為靶點(diǎn)治療CML的潛在可行的治療策略。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41419-020-2519-8