鈣離子成像原料？
鈣離子成像原料？鈣熒光探針實驗注意事項
單波長鈣測量
使用最方便、最快的Ca2+指示劑是單波長染料。這些通常用于指示活動，它們對共焦成像更友好，因為它們通常與常見的激發(fā)和發(fā)射波長以及光源相匹配。
Fluo-4相對明亮且穩(wěn)定，因此可以在較短的曝光時間內(nèi)獲得強(qiáng)信號，并且光毒性最小，因為它也不需要產(chǎn)生更多活性氧的紫外線波長。Fluo-4是一種低親和力的Ca2+指示劑，這意味著它可以在飽和前測量高Ca2+濃度，但在低Ca2+濃度（如靜息細(xì)胞的Ca2+濃度）下測量效果不佳。在單波長測量中，通常使用比率F（t）/F（0）比較活動期間的熒光發(fā)射與靜止?fàn)顟B(tài)的熒光發(fā)射。Ca2+濃度的定性測量可以通過這種方式實現(xiàn)，但這對定量測量造成了限制，需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以解釋實驗內(nèi)和實驗間的變化。潛在問題包括研究期間細(xì)胞的染料負(fù)載不均勻、光漂白和染料從細(xì)胞中泄漏。
Rhod Dyes?
另一組單波長Ca2+指示劑是Rhod染料。雖然應(yīng)用不太廣泛，但值得注意的是，它們將激發(fā)和發(fā)射轉(zhuǎn)移到更長的波長。例如，X-rhod-1的激發(fā)波長為580 nm，發(fā)射波長為600 nm。這種波長向紅色偏移的原理有助于減少組織內(nèi)的光毒性、自體熒光和光散射效應(yīng)，因此紅色區(qū)域的Ca2+指示劑數(shù)量繼續(xù)增加。在更長波長下工作的另一個好處是允許與其他熒光蛋白標(biāo)記進(jìn)行多路復(fù)用，或者可能促進(jìn)使用通道視紫紅質(zhì)對膜電位的光遺傳學(xué)控制（Lock et al.，2015）。
細(xì)胞內(nèi)鈣Fura-2，Indo-1的比例染料
定量染料對定量工作很有用，因為它們可以校正成像條件和樣品制備中的許多變化，例如染料濃度的變化或光漂白效應(yīng)。這允許在不同實驗之間對數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化。比例Ca2+指示劑的發(fā)射光譜或吸收光譜隨著局部Ca2+濃度的變化而發(fā)生變化。這些染料的乙酰甲氧基（AM）酯化形式是首選的，因為它們在細(xì)胞膜上擴(kuò)散，并被細(xì)胞內(nèi)酯酶裂解，使細(xì)胞裝載過程更容易和有效。
Fura-2
在所有比例鈣離子指示劑中，F(xiàn)ura-2最為著名。Fura-2在340 nm和380 nm處表現(xiàn)出不同的吸收，這是Ca2+的函數(shù)（見下圖）。通過510nm左右的相對發(fā)射強(qiáng)度可以檢測到這種變化。
因此，F(xiàn)ura-2的成像協(xié)議比單波長Ca2+指示劑的成像協(xié)議更復(fù)雜，并且需要能夠在340 nm和380 nm處提供照明的光源。Fura-2成像需要340 nm和380 nm的連續(xù)照明，檢測波長為510 nm，然后計算這對發(fā)射圖像的像素比率。通過對自由離子濃度進(jìn)行校準(zhǔn)，可以進(jìn)一步分析圖像。Fura-2對Ca2+具有很高的親和力，因此非常適合在低水平下精確定量測量Ca2+，但不適用于非常高的濃度（通常高于1μM）。然而，有一些Fura-2染料的親和力較低，可以在較高的Ca2+濃度下進(jìn)行測量。
Indo-1
另一種著名的比例染料是Indo-1，但在這種情況下，染料在405 nm和485 nm處的兩個峰值附近改變其發(fā)射效率。Indo-1的激發(fā)波長約為340 nm，可以用以405 nm和485 nm發(fā)射峰為中心的濾光片依次成像。
與Fura-2一樣，圖像是像素級的，可以根據(jù)游離Ca2+濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。Indo-1的一個潛在問題是，在某些實驗條件下，它可能相對不穩(wěn)定。它通常用于流式細(xì)胞術(shù)測量，而這不是問題。
