細菌糖工程用于生產(chǎn)治療性糖蛋白已經(jīng)成為一種有效的策略。與傳統(tǒng)化學和化學酶過程需要復雜的偶聯(lián)步驟相比，細菌“活細胞工廠”可以直接在體內(nèi)生物合成糖蛋白，避免了致病菌的大規(guī)模發(fā)酵，簡化了制造過程。此外，在微生物發(fā)酵過程中可以實現(xiàn)低成本、短時間和高細胞密度生產(chǎn)目標糖蛋白，因此開發(fā)高效經(jīng)濟環(huán)保的糖蛋白生產(chǎn)平臺具有很大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

近日，來自南開大學的青蓮百奧合作客戶在《Green Chemistry》期刊上發(fā)表了一篇題為“Sustainable production of a polysaccharide-based glycoprotein by simultaneous conversion of glucose and glycerol in engineered?Escherichia coli”的研究文章。在這項研究中，通過細菌糖工程技術改造大腸桿菌并優(yōu)化發(fā)酵條件生產(chǎn)目標糖蛋白，開發(fā)了可持續(xù)、高效綠色的糖蛋白生產(chǎn)平臺。

【標題】Sustainable production of a polysaccharide-based glycoprotein by simultaneous conversion of glucose and glycerol in engineered?Escherichia coli

【期刊】Green Chemistry（IF=9.8）

【見刊時間】2023.05

研究背景

尿路感染(UTI)是一種由尿路致病性大腸桿菌(UPEC)引起的傳染病，然而普遍的血清群O4對大多數(shù)抗生素耐藥，因此研究針對O4血清群的保護性疫苗具有重要意義?；谔堑鞍组_發(fā)抗菌疫苗有良好的前景，但是需要復雜的連接策略和化學試劑，且目前化學酶合成成本高且對環(huán)境不友好。開發(fā)高效可持續(xù)、環(huán)境友好的糖蛋白制造平臺具有很大應用潛力。

研究思路

本研究通過高協(xié)同代謝效率的葡萄糖/甘油混合物偶聯(lián)，開發(fā)了O -糖基化大腸桿菌底盤，安裝O-抗原基因簇以生物合成糖蛋白。隨后，通過調(diào)節(jié)相應酶的表達和優(yōu)化發(fā)酵條件提高糖蛋白的表達量。質(zhì)譜驗證目標糖蛋白的生物合成和高效糖基化（青蓮百奧提供技術服務），最后在小鼠模型中評價糖蛋白的免疫保護性。

研究內(nèi)容

一、大腸桿菌的O-抗原多糖糖工程技術

為了構(gòu)建多糖合成途徑，通過PCR鑒定尿路致病性大腸桿菌O4 O-抗原基因簇rfb的結(jié)構(gòu)，與之前的報告類似。在野生型MG1655中觀察到脂質(zhì)A，并不是LPS的最佳結(jié)構(gòu)，表明OPS4的異源生物合成被阻斷。野生型大腸桿菌MG1655中存在的一些天然代謝途徑可能會干擾OPS4的生物合成。因此需要一個優(yōu)化的糖工程底盤，通過刪除參與競爭性生物合成途徑的基因來提高OPS4的生物合成效率。

二、大腸桿菌底盤菌株的設計和構(gòu)建以提高OPS4的產(chǎn)量

本研究的核心目標是高效合成基于OPS4的糖蛋白，通過從大腸桿菌MG1655中刪除了32個與競爭途徑相關的基因，并引入了28個與糖蛋白生物合成相關的基因，從而成功地生產(chǎn)了目標重組糖蛋白。

三、增強細胞內(nèi)NDP糖前體的生物合成以增加糖蛋白的產(chǎn)生

通過組合不同強度的啟動子可以實現(xiàn)基因表達的微調(diào)，提高生物合成效率。通過組合三種不同表達強度的啟動子(強:J23119，中:J23108，弱:J23113)，調(diào)節(jié)dTDP-L-Rha和UDP-L-FucNAc通路的表達水平。構(gòu)建18個質(zhì)粒變體分別導入TD14中產(chǎn)生糖蛋白，菌株AGO08的蛋白質(zhì)和糖含量最高，其次是AGO10。因此在18株重組菌株中，選擇AGO08和AGO10進行進一步優(yōu)化。

四、質(zhì)譜法評價糖蛋白糖基化

采用質(zhì)譜法對重組糖蛋白進行定性和定量分析。對照菌株TD14和高產(chǎn)菌株AGO08純化后的糖蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，經(jīng)GluC處理進行LC-MS/MS分析。與TD14的糖蛋白相比，AGO08的糖蛋白出現(xiàn)了6種類型的修飾，這表明基因表達的微調(diào)不僅可以增加NDP糖的供應，還可以增加聚糖密度，從而提高糖蛋白的生物合成效率。

五、優(yōu)化培養(yǎng)條件使糖蛋白產(chǎn)量最大化

為了進一步提高糖蛋白的產(chǎn)量，在誘導過程中通過改變IPTG濃度、誘導溫度和細胞密度來優(yōu)化培養(yǎng)條件。在28℃、OD600 = 0.6、1.5 mM IPTG條件下，發(fā)酵48 h后，AGO08產(chǎn)生的糖蛋白滴度為27.71±1.03mg L?1。

六、AGO08產(chǎn)生的糖蛋白可誘導保護性免疫反應

為了檢驗CTB-O4糖蛋白是否能增強對UPEC -O4的保護作用，按預定時間免疫各組小鼠，檢測UPEC-O4 -小鼠UTI模型特異性IgG抗體反應。值得注意的是，用糖蛋白免疫的小鼠比其他兩組產(chǎn)生更高水平的特異性IgG。然后評估CTB-O4糖蛋白對腎臟和膀胱中細菌的清除能力。在UPEC-O4攻擊48小時后，糖蛋白接種小鼠的腎臟細菌負荷比PBS接種小鼠減少了44倍，比CTB接種小鼠減少了20倍。在膀胱中，糖蛋白給藥組細菌數(shù)量比單獨給藥CTB減少26倍，比單獨給藥PBS減少41倍。結(jié)果表明糖蛋白可以增強免疫原性，并對腎臟感染提供有效的保護。

研究總結(jié)

該研究通過對大腸桿菌改造，提高NDP前體的生物合成及優(yōu)化發(fā)酵條件產(chǎn)生目標糖蛋白。小鼠模型驗證糖蛋白針對UPEC有良好的免疫保護性。該研究為開發(fā)可持續(xù)、環(huán)境友好型的高價值治療性糖蛋白制造平臺提供了指導。