紅細胞具有來源廣泛、體內(nèi)半衰期長、生物相容性好優(yōu)勢，可用于體內(nèi)藥物遞送和緩解腫瘤乏氧等方面。不僅如此，紅細胞還能通過產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)清除病原體，參與先天免疫。然而，由于紅細胞微米級的大尺寸，極大限制了其在腫瘤內(nèi)部的滲透和富集，此外，紅細胞還面臨著儲存條件苛刻、易被細菌和病毒污染、以及需要嚴格配型等不利因素。更為重要的是，血紅蛋白的攜氧能力和ROS的生成能力有限，使得直接利用紅細胞作為載體的ROS療法在腫瘤治療中難以取得理想的治療效果。因此，我們設計合成了一種納米尺寸、且具有光動力/化學動力(PDT/CDT)和多種類酶活性(類過氧化氫酶和類谷胱甘肽過氧化物酶)的人工紅細胞(FTP@RBCM)，通過引發(fā)胞內(nèi)的自由基風暴，有效殺傷腫瘤細胞，同時造成腫瘤細胞的免疫原性死亡，進一步協(xié)同Tim-3免疫檢查點阻斷療法，能夠?qū)崿F(xiàn)“遠端效應”，抑制遠端瘤的生長。

Red Blood Cell-Mimic Nanocatalyst Triggering Radical Storm to Augment Cancer Immunotherapy

Jiong Li, Sijia Wang, Xinyi Lin, Yanbing Cao, Zhixiong Cai, Jing Wang, Zhenxi Zhang, Xiaolong Liu, Ming Wu*, Cuiping Yao*

Nano-Micro Letters (2022)14:?57

本文亮點

1.?構建同時具有光動力/化學動力、類過氧化氫酶和類谷胱甘肽過氧化物酶活性的仿生紅細胞納米催化材料(FTP@RBCM)，F(xiàn)TP@RBCM可以引發(fā)自由基風暴殺傷腫瘤細胞，同時造成腫瘤細胞的免疫原性死亡。

2.?FTP@RBCM結合Tim-3免疫檢查點阻斷能夠系統(tǒng)性地增強機體的抗腫瘤免疫效應，同時抑制原發(fā)瘤和遠端瘤的生長。

內(nèi)容簡介

西安交通大學姚翠萍教授團隊和福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院吳名、劉小龍教授團隊合作開發(fā)了一種與天然紅細胞組成相近擬合物—紅細胞膜包覆的Fe-卟啉基金屬有機框架化合物(FTP@RBCM)。FTP@RBCM可以有效發(fā)揮光動力/化學動力的作用，同時具有類過氧化氫酶和類谷胱甘肽過氧化物酶活性，能夠促進活性氧自由基(ROS)在胞內(nèi)的大量蓄積，形成自由基風暴，殺傷腫瘤細胞；外層紅細胞膜的包覆延長了FTP@RBCM在體內(nèi)的循環(huán)時間，增加了其在腫瘤部位的富集。更為重要的是，胞內(nèi)的ROS風暴還能引發(fā)局部炎癥和腫瘤細胞的免疫原性死亡，結合Tim-3免疫檢查點抑制劑，既可以有效治療原發(fā)瘤，又可以抑制遠端瘤的生長。

圖文導讀

I?FTP@RBCM的制備和表征

首先，通過乙二醇還原法合成粒徑約為3 nm的鉑(Pt)納米顆粒，隨后再將Pt納米顆粒摻入Fe-卟啉金屬有機框架化合物FTPs中(圖1a)。透射電鏡(TEM)及其元素MApping圖譜(圖1b)均可證明Pt納米顆粒的成功修飾。將提取的小鼠紅細胞膜包覆在FTPs表面，可得到尺寸均一、形貌為梭形(長為223±24 nm；寬為110 nm±19 nm)的人工紅細胞納米催化材料FTP@RBCM(圖1c)。通過包膜前后納米材料的考馬斯染料再次證實了紅細胞膜的成功包覆，同時也證明膜蛋白組分在修飾前后并沒有發(fā)生明顯的改變(圖1d)。

圖1.?(a) FTPs的TEM圖像；(b) FTPs的元素MApping圖譜；(c)?人工紅細胞FTP@RBCM的TEM圖像；(d) FTP@RBCM的SDS-PAGE圖。

II?FTP@RBCM反應活性的表征

人工紅細胞FTP@RBCM同時具有光動力/化學動力，以及類過氧化氫酶和類谷胱甘肽過氧化物酶活性。在含有H?O?的溶液中，F(xiàn)TP@RBCM可以引起氧氣檢測探針([Ru(dpp)?]Cl?)熒光強度(650 nm)的顯著下降(圖2a)，說明FTP@RBCM具有類過氧化氫酶活性，能夠催化H?O?生成O?。此外，在670 nm激光照射240 s后，溶液中單線態(tài)氧檢測探針SOSG的熒光(530 nm)增加了超過12倍(圖2b)，證明了其良好的光動力作用。相較于無Pt納米顆粒摻雜的FT，F(xiàn)TP在H?O?存在的條件下表現(xiàn)出更強的SOSG熒光信號(圖2c)，表明FTP@RBCM可以通過自催化產(chǎn)氧，提高1O?的生成能力。通過還原型GSH檢測試劑盒測得FTP@RBCM可以有效降低溶液中GSH的水平(圖2d)，證明其具有良好的GSH過氧化物酶活性，能夠消耗GSH，避免生成的1O?被快速清除。與此同時，通過Fe 2p的XPS圖譜可以看出，F(xiàn)TP中的Fe3?離子可以被GSH還原，生成Fe2?離子，而Fe2?離子能夠發(fā)生芬頓反應，生成羥基自由基·OH，發(fā)揮化學動力(CDT)作用(圖2e, f)。

圖2.?(a)?氧氣檢測探針([Ru(dpp)?]Cl?)的熒光光譜圖；(b) SOSG探針的熒光光譜圖；(c) SOSG探針在530 nm處的相對熒光強度；(d) 不同處理下溶液中GSH的含量；(e) Fe 2p的XPS圖譜；(f) ·OH檢測探針對苯二甲酸的熒光光譜圖。

III?FTP@RBCM的代謝、分布和抗腫瘤研究

構建Hepa1-6荷瘤小鼠模型，將用ICG標記后的FTP或FTP@RBCM通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，不同時間點收集血清，分析血藥濃度，測定出藥代動力學參數(shù)，如圖3a所示，紅細胞膜的包覆可以將納米材料的血液半衰期(t?)從14.8 h延長至24.1 h。同時觀察納米材料在小鼠體內(nèi)的分布情況，紅細胞膜的包覆可以增加納米材料在腫瘤部位的富集，并在注射5 h后達到峰值(圖3b)。在腫瘤富集達到峰值時，對荷瘤小鼠施加670 nm激光照射(100 mW/cm2，10 min)，在FTP@RBCM的多種類酶活性和PDT/CDT治療作用下，能夠顯著抑制小鼠腫瘤的生長(圖3c, d)。

圖3.?(a)?尾靜脈注射ICG標記的FTP或FTP@RBCM后，不同時間點血清中歸一化的熒光強度圖；(b) 小鼠體內(nèi)的熒光分布圖；(c) 腫瘤生長曲線；(d) 平均腫瘤質(zhì)量。

IV?自由基風暴引發(fā)的免疫學效應

人工紅細胞FTP@RBCM不僅能夠在670 nm激光照射下生成并積累大量的ROS，形成自由基風暴，殺傷腫瘤細胞，而且可以引起腫瘤細胞的免疫原性死亡(ICD)。通過對ICD分子標志物(HMGB1和CRT)的免疫熒光染色可以看出，經(jīng)FTP@RBCM孵育并施加激光照射的Hepa1-6細胞，其核內(nèi)的紅色熒光強度顯著下降(HMGB1從細胞核內(nèi)釋放)，而細胞膜上的綠色熒光明顯增強(CRT表達上調(diào))，表明FTP@RBCM引發(fā)的自由基風暴可造成腫瘤細胞的免疫原性死亡，釋放“危險信號分子”(圖4a, b)。治療3天后，取荷瘤小鼠的引流淋巴結進行流式分析，DCs細胞成熟(CD80?CD86?)的比例明顯增加(圖4c, d)。與此同時，分析腫瘤組織中的細胞因子，發(fā)現(xiàn)γ-IFN和IL-12的水平顯著升高(圖4e, f)，證明FTP@RBCM治療后可引起小鼠體內(nèi)的免疫反應。

圖4.?(a) HMGB1的免疫熒光染色圖像；(b) CRT的免疫熒光染色圖像；(c) 小鼠引流淋巴結內(nèi)DCs的成熟分析；(d) DCs成熟占比的統(tǒng)計分析；(e) γ-IFN和(f) IL-12在腫瘤組織內(nèi)的分泌表達水平。

V?FTP@RBCM協(xié)同增強Tim-3檢查點阻斷療法

人工紅細胞FTP@RBCM能夠造成腫瘤細胞的ICD，引起機體的免疫反應，進一步結合Tim-3檢查點阻斷抗體，可激發(fā)系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫響應，達到抑制遠端瘤的目的。構建Hepa1-6雙側(cè)荷瘤小鼠模型，在原發(fā)瘤內(nèi)注射FTP@RBCM進行治療，隔天腹腔注射Tim-3抗體(100 μg/只)，此后每間隔3天，注射1次抗體，共給藥3次，期間持續(xù)記錄小鼠腫瘤體積變化和生存狀況。FTP@RBCM協(xié)同Tim-3抗體治療不僅可以有效抑制原發(fā)瘤的生長，還具有“遠端效應”，并且大大延長了小鼠的生存期(圖5a-c)。整個治療過程中小鼠的體重無明顯變化，說明治療方案對小鼠的系統(tǒng)毒性較低(圖5d)?？贵w給藥結束3天后，通過流式分析小鼠脾臟和外周血中的T淋巴細胞(圖5e-g)，協(xié)同治療組能夠提高脾臟中CD3?CD8??T細胞和PBMC中CD3??T細胞的比例，表明協(xié)同人工紅細胞FTP@RBCM和Tim-3抗體治療可以激發(fā)小鼠系統(tǒng)性的免疫響應。同時，取小鼠的遠端瘤分別進行CD4?CD8??T細胞免疫熒光染色和瘤內(nèi)細胞因子表達分析(圖5h-j)，證明協(xié)同治療組不僅可以促進CD4?CD8??T細胞在遠端瘤內(nèi)的浸潤，而且可以提高顆粒酶B和γ-IFN在瘤內(nèi)的分泌表達水平。

圖5.?(a)?原發(fā)瘤生長曲線；(b) 遠端瘤生長曲線；(c) 小鼠的生存曲線；(d) 小鼠的平均體重；(e) 脾臟內(nèi)CD3?CD8??T細胞的流式分析；(f) 脾臟內(nèi)CD3?CD8??T細胞占比的統(tǒng)計分析；(g) PBMC內(nèi)CD3??T細胞占比的統(tǒng)計分析；(h) 遠端瘤內(nèi)CD4?CD8??T細胞的免疫熒光染色；(i) 顆粒酶B和(j) γ-IFN在遠端瘤內(nèi)的分泌表達水平。

作者簡介

吳名

本文通訊作者

福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院 研究員

▍主要研究領域

多模態(tài)分子影像、藥物輸送納米載體和“診療一體化”納米探針。

▍主要研究成果

福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院研究員，主持國家自然科學基金、中國博士后面上項目、福建省衛(wèi)生-教育聯(lián)合攻關項目等科研項目；以第一/通訊作者身份在iScience, Advanced Science, Theranostics, ACS Applied Materials & Interfaces, Advanced Healthcare Materials, Chemical Communications等雜志發(fā)表論文20多篇；入選福建省青年拔尖人才計劃，榮獲2015年度英國物理學會“China Top Cited Author Award”、第十三屆福建省自然科學優(yōu)秀學術論文獎。

▍Email:?wmmj0419@163.com

姚翠萍

本文通訊作者

西安交通大學 教授

▍主要研究領域

光學診療方法及應用，光學手術導航技術及儀器，體外診斷新技術與儀器。

▍主要研究成果

西安交通大學生命學院生物光子與傳感研究所副所長(主持工作)，生物醫(yī)學信息工程教育部重點實驗室教授、博士生導師，中國光學學會生物醫(yī)學光子學專業(yè)委員會常委，陜西省醫(yī)學會激光醫(yī)學分會委員，陜西省光學學會理事會理事?！都す馍飳W報》常務編委。主持國家自然科學基金項目5項。作為主要人員參與國際合作重點項目兩項，重大儀器專項兩項。在OpticsLetters, Nature Communications, Optics Express, Journal of Biomedical Optics, Journal of Biophotonics, Advanced Healthcare Materials, ACS Applied Materials & Interfaces, Drug Delivery,IEEE Transaction on Nanobioscience, Nanotechnology, 中國激光、光學學報等學術雜志發(fā)表SCI/EI收錄科技論文60余篇，以第一發(fā)明人獲授權國家發(fā)明專利5項。參與譯著三本，參編教材三部。

▍Email:?zsycp@xjtu.edu.cn

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