前列腺癌(PCa)是男性最常見的實體器官惡性腫瘤。前列腺特異性抗原(PSA)在做PCa篩查試驗時，往往導致患者的過度診斷和過度治療[1]。并且，大約30%的前列腺癌病例會發(fā)展為轉(zhuǎn)移性前列腺癌。因此，迫切需要探索PCa發(fā)展背后的詳細機制。

環(huán)狀RNA (circRNA)具有獨特的共價單鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)。高通量測序已經(jīng)確定許多circRNAs在細胞中具有關(guān)鍵的生理和病理作用。circRNAs可以通過結(jié)合和隔離microRNAs(miRNAs)來發(fā)揮其功能，也可以與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)相互作用，甚至可以通過m6A依賴的轉(zhuǎn)譯來編碼獨特的肽[2]。在功能上，環(huán)狀RNA參與許多生理過程，如維持干細胞多能性，控制細胞分化，調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡，以及血管生成。然而，circRNA在PCa中的功能仍然知之甚少。

2022年12月，浙江大學醫(yī)學院邵逸夫醫(yī)院泌尿科薛定偉教授在Clinical and Translational Medicine發(fā)表文章Exosome-derived circTFDP2 promotes prostate cancer progression by preventing PARP1 from caspase-3-dependent cleavage。與PCa相關(guān)的circRNA—circTFDP2在PCa組織和細胞系中都上調(diào)。circTFDP2通過與PARP1相互作用并阻止其發(fā)生caspase-3依賴性的分裂，從而促進PCa細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明，RBPs的eIF4A3可調(diào)節(jié)circTFDP2的進展。此外，外泌體傳遞的circTFDP2在體內(nèi)和體外都促進了PCa的腫瘤發(fā)生。本研究為前列腺癌提供了一個有前景的治療靶點。

一、?circTFDP2在PCa中高表達

作者經(jīng)過在50對PCa腫瘤和癌旁樣本中篩選circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0008304蛋白來源于TFDP2，被命名為circTFDP2，在PCa樣品中顯著上調(diào)；circTFDP2表達與Gleason評分呈正相關(guān)；circTFDP2在轉(zhuǎn)移灶的PCa患者中高表達。這些數(shù)據(jù)證實circTFDP2在前列腺癌中表達上調(diào)。

Sanger測序確認circTFDP2的環(huán)化位點。背靠背驗證其成環(huán)；放線菌素D驗證其穩(wěn)定性；核質(zhì)分離和FISH鑒定其定位于細胞核和細胞質(zhì)。這些數(shù)據(jù)證實了circTFDP2是一個環(huán)狀RNA。

二、?eIF4A3在PCa中調(diào)控circTFDP2的生物發(fā)生

先前的研究表明，幾種RBP可以調(diào)節(jié)circRNA的產(chǎn)生。因此，作者使用circinteractome數(shù)據(jù)庫(https://circinteractome.nia.nih.gov/)識別了circTFDP2側(cè)翼區(qū)域的潛在RBP位點和circTFDP2側(cè)翼區(qū)域的兩個假定eIF4A3結(jié)合位點。RIP實驗證明eIF4A3與circTFDP2的側(cè)翼區(qū)域結(jié)合。因此，作者假設eIF4A3控制circTFDP2的生物基因。過表達eIF4A3增強了circTFDP2的表達，而下調(diào)eIF4A3則降低了其表達。接下來，作者在50對PCa組織中檢測了eIF4A3的表達，結(jié)果表明，與正常組織相比，eIF4A3在PCa組織中高表達?？傊@些數(shù)據(jù)揭示了eIF4A3在PCa組織中調(diào)控circTFDP2的生成。

三、circTFDP2促進PCa細胞增殖，抑制其凋亡并促進PCa細胞遷移

為了探索circTFDP2在PCa中的具體作用，設計了circTFDP2特異性siRNAs和過表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到PCa細胞中。敲低circTFDP2顯著降低PCa細胞的增殖能力，而過表達circTFDP2則增強了PCa細胞的增殖能力，降低凋亡；而circTFDP2過表達結(jié)果相反。WB結(jié)果表明，敲低circTFDP2增加了cleaved caspase-3、PARP1和Bax的表達，降低了Bcl-2的表達；circTFDP2過表達結(jié)果相反。隨后，作者通過建立裸鼠異種移植瘤模型，在體內(nèi)檢測了circTFDP2的致癌作用。結(jié)果表明，circTFDP2的下調(diào)顯著抑制了體內(nèi)腫瘤的生長；過表達circTFDP2有相反結(jié)果。隨后，作者評估了circTFDP2在PCa細胞轉(zhuǎn)移中的作用。Transwell檢測顯示，敲低circTFDP2顯著降低了PCa細胞的侵襲和遷移能力，而過表達則相反。此外，裸鼠轉(zhuǎn)移模型的結(jié)果與細胞結(jié)果一致。綜上表示，circTFDP2促進PCa細胞增殖，抑制其凋亡并促進PCa細胞轉(zhuǎn)移。

四、?circTFDP2與PARP1相互作用并阻止其裂解

為了確定circTFDP2調(diào)控PCa進展的分子機制，我們首先分析了circRNADb數(shù)據(jù)庫(http://reprod.njmu.edu.cn/cgibin/circrnadb/ circrnadb .php)。結(jié)果顯示，circTFDP2不存在內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)或開放閱讀框(ORF)區(qū)域，提示circTFDP2蛋白編碼潛力較低。

隨后，由于circTFDP2同時位于細胞核和細胞質(zhì)中，猜測circTFDP2可能具有miRNA海綿的功能。但AGO2-RIP實驗表明，circTFDP2不能與AGO2蛋白相互作用，表明其不能作為miRNA海綿。

接下來，作者設計circTFDP2探針進行pulldown實驗，發(fā)現(xiàn)有26個蛋白與circTFDP2特異性相互作用。在這些RBP中，PARP1由于可以抵抗前列腺癌癥，被選為潛在的下游。PARP1-RIP實驗證實了PARP1與circTFDP2之間的相互作用。FISH和IF檢測確定了PARP1和circTFDP2之間的共定位。這些數(shù)據(jù)表明circTFDP2和PARP1在PCa細胞中形成了RNA蛋白復合物。

基于PARP1和circTFDP2之間的相互作用，作者研究了PARP1是否影響circTFDP2的表達。結(jié)果顯示，circTFDP2的過表達或敲低都不能改變PARP1的表達和定位，這表明circTFDP2在轉(zhuǎn)錄后水平上沒有調(diào)節(jié)PARP1的表達。

但是，由于circTFDP2與PARP1結(jié)合，而PARP1的DNA結(jié)合區(qū)被活躍的caspase-3識別并切割，作者假設circTFDP2影響這一過程。

WB實驗顯示，過表達circTFDP2會降低裂解PARP1的表達，而敲低circTFDP2則會增加裂解PARP1的表達；circTFDP2敲低的PCa細胞中增強的PARP1裂解被caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK阻斷，表明circTFDP2阻止了PARP1依賴caspase-3的活性裂解。上述數(shù)據(jù)表明circTFDP2可以減弱PARP1的裂解。

五、?PARP1促進前列腺癌細胞增殖和遷移

PARP1是PARP中最重要的成員之一，參與應激反應、DNA修復和細胞凋亡等多種細胞過程。由于circTFDP2與PARP1結(jié)合并阻止其分裂，作者檢測了50對PCa腫瘤和癌旁中PARP1的表達。結(jié)果顯示，PARP1在PCa組織中高度表達。使用TCGA數(shù)據(jù)庫進行分析后，得到了相同的結(jié)果。CCK-8和transwell結(jié)果顯示，敲低PARP1顯著降低了PCa細胞的增殖和遷移能力，而反之則反。這些數(shù)據(jù)說明PARP1促進了PCa細胞的增殖和遷移。

六、circTFDP2通過PARP1調(diào)節(jié)前列腺癌細胞的DNA損傷

由于PARP1是單鏈斷裂修復的重要分子，作者推測circTFDP2也可能通過阻止PARP1的切割來影響DNA損傷修復。WB和IF檢測發(fā)現(xiàn)，PARP1過表達降低DNA損傷標志物yH2A.X表達，反之則反。而circTFDP2的過表達減輕了PCa細胞的DNA損傷，敲低circTFDP2的抑制加重了DNA損傷，表明circTFDP2參與了PCa細胞的DNA損傷。隨后，CCK-8檢測顯示敲低circTFDP2抑制PCa細胞的增殖能力，反之則反。這些數(shù)據(jù)表明circTFDP2通過PARP1促進了PCa的進展。

七、?外泌體遞送的circTFDP2促進前列腺癌進展

新興的研究表明，癌細胞分泌的外泌體在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)通訊中起著至關(guān)重要的作用，從而參與各種生物學過程。從PCa細胞系的細胞培養(yǎng)基中收集外泌體并進行特征分析。qPT-PCR檢測顯示，細胞培養(yǎng)基中的外泌體比細胞質(zhì)中的外泌體含有更多的circTFDP2。并且，circTFDP2在過表達的PCa細胞培養(yǎng)液中的外泌體中含量更高。為了探索外泌體遞送的circTFDP2在PCa細胞進展中的作用，作者進行了CCK-8和transwell檢測。結(jié)果表明，來自circTFDP2過表達細胞的外泌體增強了PCa細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。體內(nèi)異種移植瘤模型結(jié)果和體外細胞結(jié)果一致。綜上所述，外泌體遞送的circTFDP2促進了前列腺癌的進展。

原文鏈接

https://doi.org/10.1002/ctm2.1156

參考文獻

[1]?Vlachaki A, Baltogiannis D, Batistatou A, et al. Screening for?prostate cancer: moving forward in the molecular era. J BUON.2018;23:1242-1248.

[2]?Singh S, Shyamal S, Panda AC. Detecting RNA–RNA interactome. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2022;13:e1715.

轉(zhuǎn)載請聯(lián)系郵箱授權(quán)：circRNA@163.com