Jackson公司SDS-PAGE?進(jìn)行蛋白質(zhì)分離前言：

一旦準(zhǔn)備好，樣品蛋白質(zhì)通過(guò)?PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離，這可以在天然或變性條件下進(jìn)行。蛋白質(zhì)印跡指南的這一部分詳細(xì)介紹了您在分離蛋白質(zhì)時(shí)可能需要考慮的事項(xiàng)。

?

SDS-PAGE?通常用于蛋白質(zhì)印跡，其中蛋白質(zhì)被變性和還原以獲得它們的初級(jí)結(jié)構(gòu)。用?SDS?分子（十二烷基硫酸鈉）包被會(huì)產(chǎn)生與其分子量成正比的相對(duì)負(fù)電荷，從而允許僅按大小分離蛋白質(zhì)。Native PAGE?省略了?SDS?的使用，用于觀察不同的蛋白質(zhì)特征。它很少通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步處理，更常見的是用考馬斯或銀染色。天然?PAGE?中的蛋白質(zhì)遷移率取決于電荷和流體動(dòng)力學(xué)大小，這由多肽折疊決定。以特定方式折疊的小蛋白質(zhì)可能比更大、更緊密折疊的多肽具有更大的流體動(dòng)力學(xué)尺寸。此外，可以保留多聚體結(jié)構(gòu)。

?

SDS-PAGE?是通過(guò)將蛋白質(zhì)引入丙烯酰胺凝膠基質(zhì)并施加電流將帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)拉過(guò)凝膠來(lái)進(jìn)行的。丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的密度阻礙了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。較小的蛋白質(zhì)比較大的蛋白質(zhì)更快地通過(guò)凝膠，在電泳期間通過(guò)凝膠更遠(yuǎn)，并且看起來(lái)更接近凝膠的末端。相反，較大的蛋白質(zhì)抵抗遷移并保持更接近凝膠的開始。包含已知大小蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)標(biāo)記可以與樣品同時(shí)加載，以校準(zhǔn)分離蛋白質(zhì)的大小。

?

也可以使用其他類型的凝膠，這些凝膠通過(guò)大小以外的特性分離蛋白質(zhì)。例如，等電聚焦凝膠?(IEF)?凝膠根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)?(pI)?分離蛋白質(zhì)，該等電點(diǎn)對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)不帶凈電荷的?pH?值。除了凝膠本身之外，這些其他類型的凝膠通常還需要專門的緩沖液和分子量標(biāo)記。

?

將蛋白質(zhì)樣品裝入樣品孔中，在夾在兩個(gè)緩沖液室之間的聚丙烯酰胺凝膠中形成細(xì)齒。垂直電泳儀如圖?1?所示。

?

個(gè)室連接到陰J，樣品加載孔暴露在此處，第二個(gè)室連接到凝膠末端的陽(yáng)J。施加電壓，蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠向陽(yáng)J移動(dòng)。?

?

蛋白質(zhì)大小和凝膠基質(zhì)的密度決定了分離的速度；較小的蛋白質(zhì)比較大的蛋白質(zhì)遷移得更快。

?

準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)鑒定和定量需要高質(zhì)量的分離。必須使用適當(dāng)?shù)哪z特性和上樣濃度來(lái)確保充分分離。

?

Jackson公司：聚丙烯酰胺凝膠

?

聚丙烯酰胺凝膠用作分離基質(zhì)。

堅(jiān)固、親水、熱穩(wěn)定、透明和相對(duì)化學(xué)惰性，這確保了在過(guò)程中不會(huì)破裂或熔化，并且蛋白質(zhì)很容易觀察到。

?

化學(xué)反應(yīng)不會(huì)干擾蛋白質(zhì)遷移，并且由凝膠密度控制的孔徑可以變化。

?

不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠

PAGE?中使用的大多數(shù)凝膠由兩個(gè)凝膠區(qū)域形成：由較低密度凝膠制成的濃縮凝膠和較高密度的分離凝膠。

?

較小的蛋白質(zhì)通過(guò)濃縮膠快速遷移，并阻礙了通過(guò)分離膠的遷移。

?

較大的蛋白質(zhì)通過(guò)濃縮膠緩慢遷移，可能不會(huì)滲透到分離膠中。

?

梯度凝膠

梯度凝膠用于允許在同一測(cè)定中分離不同分子量范圍的蛋白質(zhì)，從而允許從同一樣品中分離低分子量和高分子量蛋白質(zhì)。凝膠的選擇取決于所需的蛋白質(zhì)分離。

?

聚合和澆注凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是通過(guò)化學(xué)或光引發(fā)聚合丙烯酰胺單體和?N,N'-亞甲基-雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的溶液制成的。聚合的化學(xué)引發(fā)使用過(guò)硫酸銨等化合物引發(fā)反應(yīng)，使用?N,N,N',N'-四亞甲基二胺等化合物來(lái)穩(wěn)定鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。聚合的光引發(fā)使用核黃素，將其添加到溶液中并暴露在玻璃板之間的長(zhǎng)波紫外線下，并用水飽和的丁醇覆蓋。這不包括抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分子氧。

?

凝膠的密度由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的濃度決定。增加丙烯酰胺濃度會(huì)增加凝膠密度。有多種厚度的預(yù)制凝膠可供選擇，但手工澆注凝膠是博士學(xué)位。通過(guò)儀式。

?

高分子量蛋白質(zhì)

PAGE?可用于分離?5?至?200 kDa?的蛋白質(zhì)。對(duì)于大分子量蛋白質(zhì)（700–4,200 kDa），瓊脂糖凝膠比聚丙烯酰胺凝膠提供更好的分離。（表一）

?

Jackson公司：緩沖液?pH

pH?影響蛋白質(zhì)遷移；因此，運(yùn)行緩沖液的?pH?值必須高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，以保持其凈負(fù)電荷，因此它們向陽(yáng)J移動(dòng)。連續(xù)密度凝膠在兩個(gè)腔室中使用相同的緩沖液，而不連續(xù)凝膠則需要不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)。通常使用?Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠?pH?值約為?7.0，分離膠?pH?值介于?8.0?和?9.0?之間。需要時(shí)可以使用其他專門的緩沖系統(tǒng)。例如，在分離J低分子量的蛋白質(zhì)/肽時(shí)，Tricine?緩沖液是理想的選擇。

?

在高?pH?分離凝膠中，半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵。為了解決這個(gè)問題，可以將還原劑添加到緩沖液中。如果正在執(zhí)行天然?PAGE，則可以添加緩沖范圍為?7.4?至?8.8?的兩性離子氨基酸，例如曲辛堿，作為替代溶液。

?

Jackson公司：用分子量標(biāo)記確定蛋白質(zhì)大小

蛋白質(zhì)大小根據(jù)分子量標(biāo)記進(jìn)行校準(zhǔn)。這些由一系列具有已知分子量的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)與樣品同時(shí)在平行通道中運(yùn)行。

?

未知多肽的分子量可以通過(guò)計(jì)算標(biāo)記物的相對(duì)遷移距離?(Rf)?與感興趣的蛋白質(zhì)行進(jìn)的距離相比較來(lái)估計(jì)。分子量標(biāo)記也是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的有用指標(biāo)。

?

預(yù)染分子量標(biāo)記可用于監(jiān)測(cè)電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)遷移的進(jìn)程。在添加免疫試劑之前，還可以通過(guò)用染料（例如麗春紅?S）暫時(shí)染色膜來(lái)觀察標(biāo)記物。如果凝膠不進(jìn)行免疫印跡，可以在電泳后用考馬斯亮藍(lán)或銀染色來(lái)觀察未標(biāo)記的標(biāo)記物。（表二）

?

陰性組織對(duì)照

陰性對(duì)照使用已知不表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞或組織樣本。當(dāng)這些與未知樣品一起運(yùn)行時(shí)，不應(yīng)檢測(cè)到與目標(biāo)蛋白大小相同的對(duì)照帶。運(yùn)行陰性對(duì)照以識(shí)別一抗的非特異性檢測(cè)。陰性對(duì)照信號(hào)表明一抗與樣品中的蛋白質(zhì)相互作用，而不是感興趣的蛋白質(zhì)，例如培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。

?

另一種有用的陰性對(duì)照是免疫印跡，其中一抗被排除在外，通常稱為無(wú)一抗對(duì)照。此類對(duì)照中的陽(yáng)性信號(hào)表明二抗與樣品中的蛋白質(zhì)直接結(jié)合。例如，如果樣品中含有小鼠?IgG，則使用小鼠組織樣品的蛋白質(zhì)印跡可能會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，這將被抗小鼠?HRP?偶聯(lián)的二抗檢測(cè)到。

?

加載控件

上樣對(duì)照用于評(píng)估?PAGE?的一致性，它們產(chǎn)生的信號(hào)可用于在定量過(guò)程中使孔之間的測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。

?

上樣控制的一種形式是測(cè)量來(lái)自每個(gè)樣品中摻入的蛋白質(zhì)的信號(hào)。這可用于確認(rèn)在電印跡過(guò)程中從凝膠均勻轉(zhuǎn)移到膜上，并可用于在分析過(guò)程中使孔之間的信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化。在組成樣品的組織或細(xì)胞中表達(dá)的管家蛋白，例如肌動(dòng)蛋白，可用作上樣對(duì)照。特別是，他們確認(rèn)孔中裝載了相同數(shù)量的樣品，并且可以識(shí)別樣品處理差異。

?

Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務(wù)領(lǐng)域覆蓋各大學(xué)科研所和醫(yī)院里的動(dòng)物研究以及生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)的科學(xué)家。艾美捷科技是Jackson公司的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。