前言

在飼料中添加益生菌和合生制劑改變了虹鱒魚的腸道菌群，了解飼料類型和不同的生物添加劑如何塑造腸道微生物群，以及宿主和細(xì)菌之間的生物相互作用，對(duì)于持續(xù)提高動(dòng)物生產(chǎn)的可持續(xù)性至關(guān)重要。

2022年1月，哥本哈根大學(xué)Jacob Agerbo Rasmussen研究員及其課題組在《Microbiome》(IF:14.650)期刊發(fā)表了題為“A multi-omics approach unravels metagenomic and metabolic alterations of a probiotic and synbiotic additive in rainbow trout ”的研究成果，通過將腸道內(nèi)容物樣本的多組學(xué)研究及數(shù)據(jù)分析（包括16S rRNA、宏基因組和非靶向代謝組學(xué)）進(jìn)行互補(bǔ)與整合，研究細(xì)菌宏基因組組裝基因組(MAGs)及其與宿主代謝的分子相互作用。

研究背景

益生菌和益生元通常被認(rèn)為可以通過減少腸道病原體的流行、改變生長(zhǎng)相關(guān)的菌群代謝物的合成來促進(jìn)腸道健康和魚的生長(zhǎng)。盡管已證明與益生菌相關(guān)的乳酸菌、片球菌和亮念珠菌存在于鮭魚的腸道微生物群中，但在魚腸道環(huán)境中運(yùn)用腸道免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的功能知之甚少。因此，作者通過挖掘與魚相關(guān)的腸道微生物群功能來更好地研究魚生長(zhǎng)性能的相關(guān)機(jī)制。

研究思路

實(shí)驗(yàn)方法

1.研究材料：虹鱒魚魚卵

2.飼料性能分析

3.16S rRNA基因測(cè)序分析

4.宏基因組研究及宏基因組生物信息學(xué)：篩選、組裝、裝箱、翻新和功能分析

5.代謝組學(xué)研究及注釋和代謝物亞結(jié)構(gòu)分析

6.細(xì)菌相關(guān)代謝物的代謝組學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析和亞結(jié)構(gòu)分析

研究結(jié)果

飼料添加劑和養(yǎng)分利用

根據(jù)三個(gè)飼養(yǎng)組中虹鱒魚的體積、重量和數(shù)量來評(píng)估其飼料性能。通過記錄每個(gè)貯箱飼料的登記，以及近紅外光譜測(cè)定的各飼料組的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)幼年虹鱒魚的營(yíng)養(yǎng)相關(guān)表型，如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝，可以通過功能性飲食來影響。研究分析顯示喂養(yǎng)組間的體重增加(WG)、飼料轉(zhuǎn)化比(FCR)和FCR的倒數(shù)，飼料優(yōu)勢(shì)比(FER)沒有顯著的差異（圖1A、B）。脂質(zhì)利用比(LER)表明，PRO組的飼料脂質(zhì)顯著轉(zhuǎn)化為生物量(F（2,12）=9.84，p=0.0029)(圖1c)，表明該組飼料的使用提高了脂質(zhì)利用效率。蛋白質(zhì)濃度比(PER)分析顯示，CTRL組的效率明顯高于其他喂養(yǎng)類型(F（2,12）=9.88，p=0.0029)1D)。

圖1 | 喂養(yǎng)試驗(yàn)的性能試驗(yàn)

Pro添加劑和共生添加劑與整個(gè)虹鱒魚腸道中支原體相對(duì)豐度的減少有關(guān)

通過比較不同的飲食組中16S rRNA基因分析探究整個(gè)腸道微生物組成變化，發(fā)現(xiàn)不同組菌群分布有明顯變化。CTRL組主要由支原體組成，其他兩組中Massilla及 endosym biont8占較高比例（圖2a）。主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示，96.4%的微生物區(qū)系變異可由兩個(gè)主成分解釋，CTRL組的微生物區(qū)系單獨(dú)聚集，而PRO和SYN的微生物區(qū)系聚集在一起(圖2b)。多樣性分析顯示豐度并不受腸道部分和飼料影響(圖2c)。與CTRL組相比，特別是對(duì)于高度豐富的物種(圖2e)，PRO和SYN組有更高的微生物多樣性(圖2d)。

對(duì)前50個(gè)最豐富的asv進(jìn)行周向豐度分析，CTRL組支原體豐度顯著升高，表明飼料添加劑可能對(duì)支原體和雙歧桿菌的存在有抑制作用(圖2f)。另一方面，與CTRL相比，PRO和SYN中變形菌門、梭狀芽孢桿菌科、假單胞菌、馬氏菌、葡萄球菌等屬均有所增加(圖2f)。

圖2 | 腸道微生物群的喂養(yǎng)類型和腸道切片的16SrRNA基因分析

支原體的豐度與已知的與鮭魚代謝相關(guān)的微生物途徑相關(guān)

對(duì)宏基因組數(shù)據(jù)分析，虹鱒魚宏基因組的研究具有足夠的測(cè)序深度(圖3a)。利用同源基因聚類(COGs)對(duì)orf進(jìn)行注釋。比較不同攝食類型中COGs的平均基因覆蓋率，發(fā)現(xiàn)CTRL組與包括添加劑(PRO組和SYN組)在內(nèi)的攝食類型之間存在明顯的差異，其中CTRL組在大多數(shù)類別中COGs的覆蓋率最高(圖3b)。

此外，對(duì)樣品和喂養(yǎng)類型之間的COGs組成的調(diào)查顯示，4個(gè)CTRL樣品之間具有很高的相似性。TeCTRL樣本聚集在遠(yuǎn)離PRO和SYN之外，除了一個(gè)SYN樣本(圖3c)。對(duì)SCG結(jié)果的分析顯示，6個(gè)SCG的密度最高，表明在虹鱒魚的宏基因組中存在小于6個(gè)不同的細(xì)菌基因組(圖3d)。

圖3 | 不同喂養(yǎng)類型的宏基因組變異

用Westernblot和逆轉(zhuǎn)錄定量PCR驗(yàn)證相對(duì)和絕對(duì)定量數(shù)據(jù)

在PRO和SYN組中，乳酸菌和腸桿菌科的相對(duì)豐度都較高，支原體生物量減少(圖4a)。在不同喂養(yǎng)組間宏基因組的功能潛力也有顯著差異。宏基因組數(shù)據(jù)的周向豐度分析顯示，總共5574個(gè)非冗余基因中有670個(gè)在CTRL中顯著升高，并且發(fā)現(xiàn)來自非甲戊酸(MEP)途徑的萜類主干合成編碼基因在CTRL組中富集，包括ispE、ispF、ispG和ispH(圖4a，b)。

圖4 | 來自不同喂養(yǎng)類型和腸道切片的腸道微生物組的基因組解析

飲食和支原體的豐富與虹鱒魚的腸道代謝有關(guān)

隨后進(jìn)行全譜代謝組學(xué)研究，作者運(yùn)用UHPLC-MS/MS檢索出7190種代謝物（56.59%）。在9723種代謝物中，有741種代謝物被納入研究?？傮w代謝變化顯示CTRL、PRO和SYN組之間存在明顯差異(圖5a)。CTRL和其他兩種飼料類型之間代謝物亞類組成有明顯的差異，包括氨基酸、肽、萜類、膽汁酸、醇和衍生物（圖5b-d）。對(duì)240種已知代謝物進(jìn)行分析，得到25種不同豐度的代謝物，而其中19種代謝物在CTRL中更為豐富(圖5e)。

圖5 | 不同喂養(yǎng)類型的代謝組學(xué)分析

與腸道菌群相關(guān)的代謝物研究

為研究特異性代謝物與微生物之間的關(guān)系，作者計(jì)算了每個(gè)樣本中asv的相對(duì)豐度與代謝物子集的濃度之間的相關(guān)性。作者對(duì)26個(gè)樣本進(jìn)行包括16SrRNA基因測(cè)序和代謝組學(xué)分析。通過對(duì)350種代謝物進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)：前25個(gè)微生物相關(guān)代謝物(BAMs)及其相關(guān)分子家族。此外，作者在脂肪酸酰基分子家族中發(fā)現(xiàn)了BAMs，表明SCFAs間的關(guān)系。含有BAMs的推測(cè)網(wǎng)絡(luò)圖顯示，代謝物之間有三個(gè)亞結(jié)構(gòu)基序，包括組氨酸、烷基胺和肌酐，表明虹鱒魚的腸道細(xì)菌將氨衍生為肽（圖6）。這些研究可能符合作者對(duì)精氨酸生物合成的宏基因組觀察，包括富含氨的多肽代謝。

圖6 | 細(xì)菌相關(guān)代謝物及其分子家族的分子網(wǎng)絡(luò)

研究結(jié)論

1.飼料添加劑改變了微生物群，虹鱒魚飼養(yǎng)飼料添加劑顯著減少相對(duì)豐度的鮭魚相關(guān)沙門氏支原體在中部和遠(yuǎn)端腸道含量；

2. 宏基因組學(xué)分析揭示，菌群的精氨酸合成和萜類主鏈合成途徑的改變與支原體的存在直接相關(guān)；

3.飼料類型間腸道微生物群組成的差異與代謝組學(xué)的顯著變化直接相關(guān)，包括脂質(zhì)和類脂類代謝物、氨基酸、膽汁酸和類固醇相關(guān)代謝物。

小鹿推薦

這是一篇來自Microbiome上發(fā)表的一項(xiàng)最新研究結(jié)果，分析了在飼料中添加益生菌和合生制劑對(duì)虹鱒魚的腸道菌群組成、功能及腸道代謝產(chǎn)物的影響。不同于以前只是基于數(shù)據(jù)的推測(cè)來進(jìn)行魚類的微生物群的研究，本研究利用生長(zhǎng)性能和表征腸道環(huán)境中微生物組成的研究方法，使用多組學(xué)分析來研究復(fù)雜的宿主-微生物組間的相互作用，從而更好地評(píng)估益生菌的功能潛力，為后續(xù)研究生產(chǎn)動(dòng)物中復(fù)雜的宿主-微生物相互作用提供新思路。

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