為理解與人類疾病相關(guān)的遺傳因素，人類基因組計(jì)劃（HGP）和從患病個(gè)體獲得的DNA序列數(shù)據(jù)為此提供了前所未有的機(jī)會(huì)。癌癥中的突變可能改變許多分子活動(dòng)，而其中一個(gè)分子活動(dòng)就是蛋白質(zhì)磷酸化。當(dāng)它被改變時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)系統(tǒng)的受損和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的失調(diào)。

迄今為止，已知有3000多種人類基因的改變與疾病相關(guān)。單基因疾病，例如亨廷頓氏病，囊性纖維化，地中海貧血和鐮狀細(xì)胞性貧血，都是由單基因突變引起的。而癌癥和糖尿病等多因素疾病是由多個(gè)基因突變與環(huán)境條件之間的相互作用引起的。目前有許多已知的突變是自發(fā)的或體細(xì)胞氨基酸替換的，其中一些可能會(huì)對蛋白質(zhì)功能有著巨大影響。在這些突變集合中，我們期望能觀察到阻斷正常分子功能的功能喪失性突變，以及功能獲得性突變，也就是與正常的相比，這種影響分子功能的突變能引起失調(diào)的激活。最后，我們期望能觀察到許多并不參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的突變。

氨基酸的絲氨酸殘基（Serine），蘇氨酸殘基（Threonine）和酪氨酸殘基（Tyrosine）的磷酸化在癌癥相關(guān)蛋白中是非常常見的，并且已知在癌癥中失調(diào)。眾所周知，磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)的變化可能是由于激酶和磷酸酶功能的失調(diào)，一般是通過改變基因表達(dá)來進(jìn)行檢測。激酶或磷酸酶上的氨基酸替換直接破壞激酶或磷酸酶的穩(wěn)定性和/或功能，導(dǎo)致靶磷酸化的改變。激酶或磷酸酶調(diào)節(jié)劑同樣也有引起磷酸化改變的作用。磷酸化位點(diǎn)的破壞是與癌癥相關(guān)的，例如細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）中T286的突變。GSK3B在細(xì)胞周期蛋白D1的野生型中對T286進(jìn)行磷酸化以啟動(dòng)其核輸出，并隨后在細(xì)胞質(zhì)中降解，而磷酸化的喪失與細(xì)胞周期蛋白D1在食管癌中的核積累有著因果關(guān)系，并通常會(huì)增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。在涉及肝癌的連環(huán)蛋白β-1的另一項(xiàng)研究中，已知磷酸化發(fā)生在氨基酸T41和S45上，并導(dǎo)致顯著的磷酸化喪失。因此，磷酸化靶位點(diǎn)突變是癌癥發(fā)展的新途徑。癌癥中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)的機(jī)制是通過去除或產(chǎn)生磷酸化位點(diǎn)來介導(dǎo)的，從而導(dǎo)致磷酸化功能的喪失或獲得，這取決于磷酸化殘基的作用。我們可以發(fā)現(xiàn)幾種富含磷酸化破壞突變的通路。值得注意的是，Wnt/β-連環(huán)蛋白通路富含磷酸化位點(diǎn)的獲得以及喪失的活動(dòng)。

磷酸化可以以各種形式影響蛋白質(zhì)功能，例如增加或減少蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定它或?qū)⑵錁?biāo)記去被破壞、將其定位在特定的細(xì)胞區(qū)室內(nèi)，并且可以啟動(dòng)或破壞其與其他蛋白質(zhì)的相互作用。人類基因組編碼的21,000種蛋白質(zhì)中，超過三分之二被磷酸化，且可能有90%以上的蛋白質(zhì)受到PTM的影響。因此，磷酸化活動(dòng)在控制生物進(jìn)程如增殖，分化和凋亡中起重要作用。蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)通常具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)功能，并且是許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的核心，因此修改它們的突變有可能導(dǎo)致病理狀態(tài)，如癌癥，心血管疾病，腎臟疾病等。而磷酸化位點(diǎn)調(diào)節(jié)的重要性可能存在巨大差異。磷酸化位點(diǎn)的突變有可能通過上調(diào)或下調(diào)該位點(diǎn)磷酸化的化學(xué)計(jì)量來極大地影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。此外，突變的磷酸化經(jīng)常修改進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）的成員，這種修改是許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的核心，而另一個(gè)重要的考慮因素是破壞或改變其PPI以及整個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)上磷酸化位點(diǎn)的影響。分子相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究已越來越多地應(yīng)用于人類疾病，例如癌癥，許多已知的癌癥突變的影響可通過其對分子相互作用網(wǎng)絡(luò)的影響來理解。

應(yīng)用范圍：

在系統(tǒng)層面上研究蛋白質(zhì)磷酸化的潛在領(lǐng)域。

1.?基礎(chǔ)研究：研究磷酸化調(diào)節(jié)譜（識(shí)別相關(guān)和相反信號(hào)狀態(tài)的分子指紋分析）。

2.?疾病建模：使用基因處理工具構(gòu)建細(xì)胞和動(dòng)物的疾病模型（研究同基因背景下疾病相關(guān)基因中靶向突變的功能分析，研究疾病的病理及其發(fā)展）。

3.?基于細(xì)胞/基因的療法：基因藥物作為與缺陷基因相關(guān)的疾病可以在基因組層面上得到修正（人類治療和細(xì)胞治療的基因編輯）。

4.?藥物發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞蛋白質(zhì)內(nèi)的磷酸化位點(diǎn)及其調(diào)節(jié)作用允許使用磷酸化作為測定終點(diǎn)，并且獲得的信息可用于藥物發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)過程中的各個(gè)階段。

基因編輯開拓了改善人類健康的新方向

CRISPR作為對基因組序列提供精確，有針對性的修改和校正的技術(shù)，基因組藥學(xué)被證明具有作為針對人類疾病的治療干預(yù)的廣泛前景。此外，使用CRISPR/Cas9技術(shù)，基因組的編輯變得簡單，因此可以在體內(nèi)和體外更有效地制備和分析磷酸化位點(diǎn)的“敲入”點(diǎn)突變。

案例分析1：

使用CRISPR系統(tǒng)研究單基因肝病

威爾遜氏?。╓ilson's disease, WD）作為單基因肝病是基于ATP7B基因的突變而產(chǎn)生的，并導(dǎo)致肝臟中銅（Cu）排泄的功能惡化。過量的銅積累在各種器官，例如肝臟和大腦。威爾遜氏病患者表現(xiàn)出臨床異質(zhì)性，涵蓋了從急性或慢性肝衰竭到神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。通過鋅或螯合劑的終生治療可以改善病程，但是在相當(dāng)一部分患者中觀察到嚴(yán)重的副作用，例如神經(jīng)功能惡化和腎毒性，因此肝移植將是不可避免的。另一種治療方案則是ATP7B基因的基因校正。在這項(xiàng)研究中，研究人員使用CRISPR/Cas9基因編輯在人類細(xì)胞系中引入人工ATP7B點(diǎn)突變，并通過額外使用的單鏈寡核苷酸（ssODNs）來糾正這一突變，模擬威爾遜氏病點(diǎn)突變在體外的基因修正。

ATP7B敲除細(xì)胞（HEK293TΔC）表現(xiàn)為胞嘧啶核苷酸缺失（紅色“-”標(biāo)記）的點(diǎn)突變。Cas9在PAM區(qū)域（標(biāo)藍(lán)）上游切斷三個(gè)核苷酸（紅色箭頭標(biāo)記）。修復(fù)ssODN在位置1、2和3（ssODN_3M）或位置2和3（ssODN_2M）包含沉默阻斷突變。

用pmaxGFP脂質(zhì)轉(zhuǎn)染HEK293TΔC細(xì)胞。GFP表達(dá)水平顯示在圖3A中。對攜帶阻斷突變2號(hào)（虛線框）的ATP7B修復(fù)的純合HEK293TΔC細(xì)胞克?。ê谏颍▓D3B）和攜帶所有三個(gè)阻斷突變（虛線框）的ATP7B修復(fù)的雜合HEK293TΔC細(xì)胞克隆（黑色框）（圖3C）進(jìn)行Sanger序列分析。

這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ATP7B點(diǎn)突變校正是可行的，并且有發(fā)展臨床使用的可能。

案例分析2：

使用CRISPR/Cas9校正HCT-116細(xì)胞中的β-cateninΔTCTser45的缺失突變

結(jié)直腸癌是第三大常見癌癥。CRC與Wnt/β-catenin（β-連環(huán)蛋白）信號(hào)傳導(dǎo)通路的失調(diào)密切相關(guān)。β-catenin在Ser45被酪蛋白激酶1（CK1）磷酸化，并連續(xù)在Ser33，Ser37和Thr41被糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化，從而引起隨后的泛素化和蛋白酶體降解。這些Ser/Thr殘基的突變會(huì)改變重要的功能性磷酸化位點(diǎn)，抑制β-catenin磷酸化降解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路的組成性激活。因此，通過基因編輯技術(shù)校正β-catenin基因突變可以開發(fā)用于結(jié)腸癌的新一代治療方法。

在該研究中，人結(jié)腸直腸細(xì)胞系HCT-116被選用，因?yàn)樗哂笑?catenin基因的雜合缺失突變（ΔTCT），其負(fù)責(zé)在蛋白質(zhì)的N-末端區(qū)域編碼調(diào)節(jié)性Ser45。研究人員通過基因測序證實(shí)了ΔTCTSer45缺失突變在β-連環(huán)蛋白基因的外顯子3和CRISPR/Cas9 PAM位點(diǎn)上的位置。96 nt ssODN包含了作為HDR修復(fù)模板的野生型β-catenin基因序列。將HCT-116細(xì)胞與載體和ssODN共轉(zhuǎn)染后，通過FACS篩選GFP陽性細(xì)胞并擴(kuò)增，并通過TA克隆和測序計(jì)算突變校正效率。

由于該基因的一個(gè)等位基因中的缺失突變，HCT-116細(xì)胞中β-catenin的測序圖譜顯示從突變基因座開始的重疊峰（圖1C）。突變校正后，我們發(fā)現(xiàn)突變基因座中存在TCT序列，因此從突變基因座開始的重疊峰也相應(yīng)消失了（圖1D）。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，用Cas9-GFP/sgRNA共表達(dá)載體和ssODN共轉(zhuǎn)染可以糾正HCT-116細(xì)胞中的β-cateninΔTCTser45缺失突變。

β-catenin的Ser45是重要的磷酸化位點(diǎn)。ΔTCT密碼子的缺失突變將對HCT-116細(xì)胞中的β-cateninSer45磷酸化產(chǎn)生巨大影響。因此，研究人員研究了缺失突變體和被校正突變體中β-catenin的表達(dá)水平。如預(yù)期的那樣，與沒有β-cateninΔTCT缺失突變的DLD1大腸癌細(xì)胞相比，未校正的HCT-116細(xì)胞具有非常弱的可檢測Ser45磷酸化β-catenin表達(dá)（圖2A）。他們還研究了對照組和一個(gè)突變校正的HCT-116細(xì)胞克隆中的蛋白質(zhì)表達(dá)，即總體、核和細(xì)胞質(zhì)的β-catenin水平（圖2B）。此外，他們還比較了蛋白質(zhì)的表達(dá)以及E-cadherin（E-鈣粘蛋白），c-myc，cyclinD1和survivin基因（圖2C，D，E和F）。

總的來說，通過CRISPR/Cas9和ssODN的組合去校正驅(qū)動(dòng)突變可以極大地改進(jìn)癌細(xì)胞系的生物學(xué)行為，同時(shí)也表明該方案在癌癥的基因治療中的潛在應(yīng)用。

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