流式細(xì)胞術(shù)是一種對快速直線流動狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點(diǎn)，已經(jīng)成為近代科學(xué)研究中的熱門專題，研究它的論文數(shù)量也在逐年上升（見圖1）。流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞術(shù)為核心技術(shù)，集光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)以及激光和計算機(jī)等多門學(xué)科和技術(shù)于一體的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)備。它被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物學(xué)、微生物學(xué)、制藥學(xué)、生殖學(xué)等領(lǐng)域，是現(xiàn)代科學(xué)研究中的先進(jìn)儀器之一，被譽(yù)為實(shí)驗室的"CT"。

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圖1 在PubMed 中用關(guān)鍵詞" 流式細(xì)胞術(shù)" 搜索的文獻(xiàn)數(shù)

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1.流式細(xì)胞儀的工作原理

圖2為流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)。它主要有四部分組成：流動室和液流系統(tǒng)；光源與光學(xué)系統(tǒng)、信號收集與信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計算機(jī)與分析系統(tǒng)。具有分選功能的流式細(xì)胞儀還包括分選系統(tǒng)。將待測細(xì)胞熒光染色后制成單細(xì)胞懸液，在鞘液的包被下單行排列，依次通過流動室檢測區(qū)域。以激光作為激發(fā)光源，垂直照射檢測區(qū)域的樣品流，被熒光染色的細(xì)胞在其照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，它們同時被前向光電二極管和側(cè)向90°方向的光電倍增管接收。前向小角度的光散射信號（forward scatter,FSC）反映了細(xì)胞體積的大小；側(cè)向90°方向的光散射信號（side scatter，SSC）反映了細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜情況。激發(fā)熒光信號代表了所標(biāo)記的被測細(xì)胞內(nèi)部顆粒的信息。這些光信號轉(zhuǎn)化成電信號，被傳送到計算機(jī)，經(jīng)A/D 轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C(jī)處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存到計算機(jī)上，以備脫機(jī)后的數(shù)據(jù)處理和分析。細(xì)胞的分選是將待測液滴充以正負(fù)不同的電荷，讓其在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入不同的收集容器中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。

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圖2 流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)示意圖

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2.流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

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2.1 在臨床上的應(yīng)用

細(xì)胞癌變過程中伴隨細(xì)胞DNA 含量的改變，DNA 非整倍體細(xì)胞是惡性腫瘤的特異性標(biāo)志。流式細(xì)胞儀的FSC 能夠給出這些信息，在腫瘤的早期診斷和鑒別診斷中有著很重要的作用；早在80 年代人們發(fā)現(xiàn)特定T 細(xì)胞亞群可以反映AIDS 患者的臨床狀態(tài)，而流式細(xì)胞儀可以對這些T 細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，為AIDS 的診斷、治療提供有用信息；流式細(xì)胞儀借助于各種熒光染料測定一個細(xì)胞的多種參數(shù)完成白血病及淋巴瘤的診斷，準(zhǔn)確率達(dá)90%左右，較傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢查準(zhǔn)確性提高10%-20%；流式細(xì)胞儀對淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)量的檢測，可以探索疾病的發(fā)病機(jī)理、病程、預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療方案。

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2.2 在生物學(xué)及微生物學(xué)上的應(yīng)用

從早期到現(xiàn)在，在細(xì)胞及細(xì)胞器方面很多已被人們所接受的科技，都經(jīng)流式細(xì)胞儀研究過。在細(xì)胞功能的早期研究中，研究者僅能通過觀測微生物的吞噬來研究噬中性粒子,而流式細(xì)胞儀可以通過它們的大小、形狀、抗體及吞噬過程中微生物種類、數(shù)量的變化更深入的辨別、研究這些噬中性粒子；氧自由基的實(shí)時、單細(xì)胞繁殖評價，DNA 倍體分析，細(xì)胞循環(huán)中細(xì)胞增殖和凋亡分析等都會用到流式細(xì)胞儀；流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期可以輕松分析，促進(jìn)了以此為基礎(chǔ)的植物學(xué)的發(fā)展，輔以成像儀器，流式細(xì)胞儀可以對微生物的成長、繁殖進(jìn)行3-D 研究。

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2.3 在生殖學(xué)及制藥學(xué)上的應(yīng)用

利用對精子DNA 進(jìn)行無害標(biāo)定的DNA 染料(如Hoechst 33342)或H-Y 抗體都可以對精子進(jìn)行檢測和分類，完成生殖學(xué) 上的要求；FCM 檢測腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，對檢測臨床腫瘤化療效果及藥物的選擇有一定的意義。此外，流式細(xì)胞儀在細(xì)胞毒，可溶性蛋白質(zhì)分子，鈣離子濃度檢測等都有很廣泛的用途。此外，流式細(xì)胞儀在細(xì)胞毒，可溶性蛋白質(zhì)分子，鈣離子濃度檢測等都有很廣泛的用途。

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3.流式細(xì)胞儀的最新進(jìn)展

1）儀器功能專業(yè)化

Partec CyFlow、BD FACSCount 可以實(shí)現(xiàn)CD4,CD8,CD3 絕對計數(shù)，用于HIV 檢測的經(jīng)濟(jì)普及型流式細(xì)胞儀。CytoBuoy 公司生產(chǎn)多種用于水體微型生物分析的流式細(xì)胞儀，如CytoBuoy 可安放在浮標(biāo)上;CytoSub 可在水下200 米使用，具有特殊的耐壓裝置，以及內(nèi)部鞘液循環(huán)處理裝置，不需外部加入鞘液；CytoSense GV 裝有特殊的壓力模塊，可除去藍(lán)細(xì)菌的空胞。Bentley Instruments 公司、Delta Instruments公司和FOSS Electric 公司專門設(shè)計提供奶牛場使用的專項檢測儀，BioDETECT 公司的Yeastcyte 則是專用于酵母計數(shù)與活性分析。Union Biometrica 公司的COPAS 能夠分選果蠅、蚊子、斑馬魚等的卵和幼蟲。

2）儀器全面自動化

免疫標(biāo)本制備儀、組織樣本制備儀和樣品前處理儀在實(shí)驗中得到廣泛應(yīng)用。不同規(guī)格的多孔板或多試管自動進(jìn)樣器加速了自動化進(jìn)程。Epics XL、FACSCalibur 等主流廠家儀器都實(shí)現(xiàn)了自動化。

3）多色多參數(shù)分析迅速發(fā)展，分析、分類速度加快

新興熒光探針的不斷開發(fā)和儀器軟、硬件的逐步更新，流式細(xì)胞儀的多色熒光分析得到了迅速發(fā)展，對細(xì)胞亞群的識別更準(zhǔn)確、更精細(xì)。一種激光（如488nm 激光）同時激發(fā)多種熒光材料，目前已出現(xiàn)488nm 單激光激發(fā)5 色到7 色的儀器，如BD FACSAria和LSRII, Beckman Coulter FC500 和CyAn ADP 等；多種激光激發(fā)多種熒光染料，如Partec CyFlow ML 采用5 種激光激發(fā)13 色熒光實(shí)現(xiàn)16 個參數(shù)的分析。隨著細(xì)胞分選系統(tǒng)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀的分析、分選速度明顯加快，如BD FACSAria獲取速度達(dá)70000 個細(xì)胞/s，分選速度50000 個細(xì)胞/s，四路分選；Beckman Coulter MoFlo XDP 分析速度100000 個細(xì)胞/s，分選速度70000 個細(xì)胞/s，四通道分選。

4）儀器小型化

適應(yīng)實(shí)際需要的小型化、便攜式流式細(xì)胞儀也是一個發(fā)展的趨勢。最近幾年，微流體流式細(xì)胞儀成為研究的熱門方向，在這方面的研究也越來越多，取得了一定的科研成果。耿鑫等對微流體數(shù)字化噴點(diǎn)技術(shù)進(jìn)行了研究，使之能夠用于小型實(shí)驗室。廖錫昌等研制了熒光微芯片分析檢測器，基本實(shí)現(xiàn)了它的微型化。Shao Guocheng 等研發(fā)了帶有非共面顯微透鏡和3-D 流體聚焦單元的微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了流體聚焦單元的真正三維化。David Barat 等研究集成光學(xué)系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的自由空間光學(xué)系統(tǒng)，提出四種不同的方法，找出最佳設(shè)計方案。Segyeong Joo 等發(fā)明規(guī)格15cm×10cm×10cm、重量為800g 的微流體流式細(xì)胞儀，它能同時給出熒光信息和阻抗信息，使細(xì)胞分類更快、更容易。Md. Z. Islam 等發(fā)明用來分離干細(xì)胞的光纖耦合微流體流式細(xì)胞儀。Joel P. Golden 等發(fā)明多波長微型流式細(xì)胞儀，它可以具有532nm、635nm 波長激發(fā)，665nm、700nm 熒光探測和散射光探測的功能。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙書濤, 武曉東. 流式細(xì)胞儀的原理、應(yīng)用及最新進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 1(22): 1-3

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