簡(jiǎn)介：細(xì)胞傳代培養(yǎng)不僅是一種將細(xì)胞種保存下去的方法，而且也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)原理

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。

傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。

細(xì)胞傳代用途

1.細(xì)胞保種
2.其他類型的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)安排

材料與儀器

材料：細(xì)胞
試劑：0.25％ 胰蛋白酶工作液；RPMI1640培養(yǎng)基（含 10％ 小牛血清）
儀器，耗材：倒置顯微鏡，CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱、吸管、培養(yǎng)瓶/皿、 超凈工作臺(tái)、封口膜、酒精

細(xì)胞傳代步驟

一、貼壁細(xì)胞：以HeLa細(xì)胞的傳代培養(yǎng)為例

1. 選取生長(zhǎng)密度 80%左右即處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HeLa細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)中操作，吸去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，加入1-2 mL的PBS溶液，輕輕潤(rùn)洗，漂洗細(xì)胞以除去殘留的血清。

2. 吸去培養(yǎng)皿中的PBS溶液，加入1-2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液（消化液能夠覆蓋細(xì)胞即可），吸棄培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱消化2～3 min(如消化程度不夠，可延長(zhǎng)時(shí)間)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓且亮?xí)r，加入等體積含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。

3. 用移液槍輕柔吹打細(xì)胞使其成為細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，室溫，1000 rpm，離心5 min。

4. 離心后，用吸引器輕輕吸去上清，加入1ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1皿細(xì)胞傳2皿或3皿比例進(jìn)行傳代（不同細(xì)胞特性不同，分盤比例適當(dāng)調(diào)整），將1皿細(xì)胞的細(xì)胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。

5. 接種好的細(xì)胞，應(yīng)在培養(yǎng)皿上標(biāo)記上細(xì)胞名稱、細(xì)胞代數(shù)、本次傳代日期和操作人姓名，輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 細(xì)胞培養(yǎng) 24 h后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)密度進(jìn)行相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理或者進(jìn)行凍存處理）。

二、懸浮細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

懸浮細(xì)胞不貼壁（半貼壁細(xì)胞貼壁不緊），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具體過程如下：

1. 取狀態(tài)良好的細(xì)胞，在生物安全柜中操作，用移液管把細(xì)胞輕柔吹打均勻。

2. 把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min。

3. 輕輕吸去上清后用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1皿細(xì)胞傳2皿或3皿比例進(jìn)行傳代，把細(xì)胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。

4. 接種好的細(xì)胞，應(yīng)在培養(yǎng)皿上標(biāo)記上細(xì)胞名稱、細(xì)胞代數(shù)、傳代日期和操作人姓名．輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5. 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)密度進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理或者進(jìn)行凍存處理）。

注意事項(xiàng)
1. 把握傳代時(shí)機(jī)，已如前述，在80%~90%匯合階段最好，過早傳代細(xì)胞產(chǎn)量少，過晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳。
2. 消化時(shí)間要適度，消化時(shí)間過短細(xì)胞不易從瓶壁脫落，過長(zhǎng)細(xì)胞可脫落流失。
3. 消化液濃度要適宜，過濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反應(yīng)快，所需消化時(shí)間短，掌握不好，細(xì)胞易流失。
4. 各種細(xì)胞對(duì)消化反應(yīng)不同，有的敏感，有的遲鈍，因此應(yīng)根據(jù)所用細(xì)胞特點(diǎn)制定適宜消化措施。有的細(xì)胞附著瓶壁不牢，用吸管可從瓶壁直接吹下來，但這樣容易傷害細(xì)胞，細(xì)胞大片脫落掉，不易計(jì)數(shù)，應(yīng)盡可能采用消化法分散細(xì)胞為妥。
5. 消化傳代良好時(shí)，細(xì)胞受損害少，細(xì)胞懸液均勻，各分裝樣品中數(shù)量誤差小，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性大。
6. 無菌操作：細(xì)胞的整個(gè)培養(yǎng)過程中，無菌操作，包括操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)前要用75%酒精擦拭，試劑等瓶要75%酒精噴浴后才能放入超凈臺(tái) 。
7. 操作 動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。
8. 不同細(xì)胞，不同操作之間需要換槍頭，避免污染

常見問題
1. 吸取液體的槍頭等不能混用。?
2. 不能用手觸碰已消毒的工作部分，工作臺(tái)面上用品布局要合理。

文章來源：“鴻泉生物”公眾號(hào)，作者~歐陽(yáng)若珣
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