寫在前面

????????今天推薦的是由鄭州大學藥學院在2020年9月7日發(fā)表于Acta Pharmaceutica Sinica B（IF：11.413，JCR 醫(yī)學1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Hong-Min Liu教授，研究表明降低USP7 活性是下調 PD-L1 并使胃癌細胞對T細胞殺傷敏感的替代策略。

研究背景

????????靶向免疫檢查點如程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）和程序性死亡配體-1（PD-L1）已被批準用于治療黑色素瘤、胃癌和膀胱癌，并獲得臨床效益。盡管如此，抗PD-1/PD-L1治療對許多患者沒有作用，因此有必要為傳統(tǒng)的PD-1/PD-L1靶向免疫療法尋求一種替代策略。

摘要部分

????????作者通過癌癥基因組圖譜（TCGA）數據，發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達與胃癌中泛素特異性處理蛋白酶7（USP7）的表達呈正相關。此外，USP7直接與PD-L1相互作用來穩(wěn)定PD-L1，而降低USP7表達會減弱PD-L1/PD-1的相互作用，并使癌細胞對體外和體內的T細胞殺傷力敏感。此外，USP7抑制劑通過穩(wěn)定P53在體外和體內抑制了胃癌細胞的增殖?？傊髡叩难芯拷Y果表明，除了抑制癌細胞增殖外，USP7抑制劑還能同時下調PD-L1的表達，以增強抗腫瘤免疫反應。因此，這些數據表明，USP7抑制劑是一種抗增殖劑，也是PD-L1/PD-1阻斷策略中的一種新型治療劑，可以促進腫瘤的免疫反應。

研究內容

1.USP7和PD-L1在胃癌組織中呈正相關??? ? ?

????????為了克服臨床反應問題，找到可能調節(jié)胃癌中PD-L1數量的上游調節(jié)器是至關重要的。作者使用GEPIA的相關分析了PD-L1與其他不同的66種去泛素酶之間的相關系數，結果表明PD-L1與胃癌中的USP7相關。此外，Kmplot的Kaplan-Meier分析顯示，USP7高表達的分化差的患者比USP7水平低的患者的總生存時間更差?；谏鲜鰯祿?，USP7應該是PD-L1的上游調節(jié)器。

????????作者進一步研究發(fā)現(xiàn)USP7在乳腺癌、腎臟嗜鉻細胞、腎臟透明細胞癌（KIRC）、腎臟乳頭狀細胞癌、前列腺癌和胃癌中過度表達。為了進一步驗證這一結果，作者用IHC檢查了286個人類胃癌組織和配對的正常組織中USP7的表達。IHC結果還顯示，與相鄰的正常組織相比，USP7在胃癌患者的腫瘤中明顯過表達。為了進一步驗證人類胃癌患者樣本的這一發(fā)現(xiàn)，通過WB分析了胃癌患者樣本中PD-L1和USP7表達的相關性。WB結果表明，PD-L1表達水平與USP7表達高度相關。

研究結論：USP7與胃癌的PD-L1表達呈正相關。

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2.抑制USP7可減少胃癌細胞中PD-L1的表達??? ?

????????為了研究USP7對PD-L1的調節(jié)作用，作者在八個胃細胞系中評估了USP7和PD-L1的表達。USP7在所有測試的細胞系中都是高表達的。由于MGC-803細胞系的PD-L1和USP7的高表達，因此選擇了MGC-803細胞系來探討內源性USP7對調控PD-L1表達的影響。首先，將USP7抑制劑Almac429應用于MGC-803和小鼠胃癌細胞MFC。當用Almac4處理細胞以抑制USP7的活性時，PD-L1的表達在這兩個細胞系中以時間依賴的方式下降。此外，在MGC-803和MFC細胞系中敲低USP7，與對照細胞相比，PD-L1的表達明顯減少。

????????由于癌細胞膜上的PD-L1通過與激活的T細胞上的PD-1結合表現(xiàn)出免疫抑制作用，USP7是否對膜上的PD-L1有積極的調節(jié)作用仍不清楚。當USP7在Almac4的存在下通過基因或藥理方法活性被降低時，MGC-803細胞的膜PD-L1的數量低于親代細胞。

研究結論：抑制USP7的活性可以下調胃癌細胞中PD-L1的表達水平。

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3.USP7直接與PD-L1相互作用并促進其去泛素化和穩(wěn)定化??? ?

????????作者接下來研究USP7如何調節(jié)PD-L1的表達。首先，作者檢查了有無Almac4處理的MGC-803細胞的PD-L1 mRNA水平，沒有發(fā)現(xiàn)PD-L1的mRNA沒有明顯改變，因此作者懷疑USP7會消除PD-L1的泛素化。作者將Flag-PD-L1和HA-USP7共同轉染HEK293細胞，發(fā)現(xiàn)兩個蛋白可以發(fā)生相互作用。為了進一步驗證這些結果，用免疫沉淀法富集了MGC-803和BGC-823細胞的內源性PD-L1，可以檢測到內源性的USP7。

????????為了進一步驗證USP7可以對PD-L1進行去泛素化，在有無HA-USP7的情況下，將Flag-PD-L1與HA-His-Ub共同轉染到HEK293細胞中。在有MG132但沒有HA-USP7的情況下，PD-L1被強烈泛素化，而HA-USP7消除了PD-L1泛素化。為了測試內源性PD-L1是否也受到USP7的類似調控，在MGC-803細胞中通過基因敲除了USP7，結果表明內源性PD-L1變得不穩(wěn)定并迅速降解。同樣，用mUSP7-sgRNA慢病毒或Almac4處理MFC細胞也導致了類似的結果。

研究結論：USP7與PD-L1相互作用并使PD-L1去泛素化，從而促進PD-L1的穩(wěn)定性。

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4.阻斷USP7使癌細胞對T細胞殺傷力敏感??? ?

????????阻斷USP7誘導的PD-L1的表達量減少是否會影響PD-L1和PD-1之間的結合以及腫瘤細胞對T細胞介導的殺傷的敏感性仍不清楚。MGC-803細胞分別用USP7 sgRNA-慢病毒或Almac4處理，然后用重組蛋白可視化膜上的PD-1。正如預期的那樣，由于USP7的基因被敲除或抑制，PD-1在細胞表面的結合減少了。

????????隨后作者通過在有無USP7的情況下將活化的Jurkat細胞與MGC-803細胞共同培養(yǎng)，進行T細胞殺傷試驗。這種機理試驗顯示，敲除USP7會不間斷地激活對腫瘤細胞的細胞毒性T細胞。白細胞介素2（IL-2）是最早被發(fā)現(xiàn)并由活化的T細胞產生的細胞因子之一，它能促進CD8t T細胞的細胞毒性活性。USP7敲除后會增強IL-2在PBMC細胞中的表。

研究結論：阻斷USP7可以減弱PD-L1/PD-1的相互作用，使胃癌細胞對T細胞殺傷力敏感。

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5.抑制USP7可降低胃癌細胞的增殖和細胞周期進展

????????為了探索消除USP7是否能抑制胃癌細胞的增殖，在MGC-803對USP7進行敲除。當USP7被敲除后，MGC-803的集落形成效率受到抑制。因為MDM2和P53是USP7的底物，所以研究了MDM2和P53在MGC-803細胞中的表達，結果顯示，USP7敲除后MDM2減少，P53累積。由于P53控制著細胞周期的G2/M檢查點并調節(jié)生長停滯，當細胞暴露于Almac4時進行了細胞周期分析，Almac4可以誘導G2/M期停滯（42.22%）。此外，Almac4還能以劑量依賴的方式降低MGC-803細胞的集落形成活性并誘導MGC-803細胞中P53和P21的表達。

研究結論：阻斷USP7可以通過促進P53的穩(wěn)定性抑制胃癌細胞的增殖。

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6.抑制USP7可減少體內PD-L1的表達? ? ?

????????作者提出一個假設：敲低USP7可以影響體內的mPD-L1表達。于是，作者評估了USP7敲低的細胞對攜帶MFC Con和USP7 KD細胞的BALB/c小鼠的腫瘤生長的損害能力。與對照組相比，敲低MFC中的USP7可減少腫瘤大小，且USP7 KD細胞的小鼠在腫瘤中的mPD-L1表達較低。此外，與對照組相比，阻斷USP7后，USP7 KD組的腫瘤體積和重量都下降了。細胞毒性CD8t T細胞在調解抗PD-L1治療的抗腫瘤作用中起著關鍵作用，作者進一步研究發(fā)現(xiàn)在攜帶MFC USP7 KD細胞的小鼠中，腫瘤浸潤的活化CD8t T細胞數量明顯增加。另一方面，MFC USP7 KD的Ki-67陽性腫瘤細胞明顯減少（Ki-67的表達在常規(guī)病理調查中被廣泛用作增殖標志物，與腫瘤細胞的增殖和生長有密切關系）。

????????此外，眾所周知，P53是一種強大的腫瘤抑制因子，可以通過激活功能來消滅腫瘤。然而，它的功能通過與MDM2的相互作用被有效地抑制。由于P53和MDM2都是USP7的底物，所以測試了每個腫瘤中P53和MDM2的表達，與MFC Con組相比，MFC USP7 KD中MDM2的表達下降。同時，與MFC Con組相比，P53在MFC USP7 KD組的表達量增加。

研究結論：阻斷USP7活性可以減少mPD-L1的表達并抑制腫瘤的生長。

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結論與討論

????????在這項研究中，抑制USP7活性以劑量和時間依賴的方式減少了胃癌細胞中PD-L1的表達。盡管USP7可以直接與PD-L1相互作用，但USP7可能以間接方式穩(wěn)定PD-L1。阻斷USP7會降低PD-L1的表達，減少PD-1/PD-L1的相互作用，并使胃癌細胞對T細胞介導的殺傷作用更敏感。所有這些數據表明， USP7在胃癌中作為PD-L1的上游去泛素酶，阻斷USP7活性可以通過下調PD-L1相關的免疫抑制進而抑制腫瘤生長，從而穩(wěn)定P53并導致隨后的細胞周期停止?？傊?，作者通過研究表明USP7對PD-L1進行去泛素化，導致癌癥產生免疫抵抗，進而促進癌癥生長。

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Thank you

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原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.apsb.2020.11.005