上星期小編為大家介紹了光遺傳學(xué)技術(shù)（optogenetics）的發(fā)展、原理、常見光敏蛋白以及一般實驗方法，該技術(shù)的出現(xiàn)很快成為了科研人員熱衷的一門技術(shù)，推動了神經(jīng)生物學(xué)的快速發(fā)展。相較于傳統(tǒng)的神經(jīng)科學(xué)研究，光遺傳學(xué)擁有許多優(yōu)勢：

（1）高時空分辨率：光遺傳能在時間和空間上特異性調(diào)控基因的表達(dá)；

（2）準(zhǔn)確性：可以精確刺激指定的神經(jīng)元；

（3）無損傷性：對實驗動物的創(chuàng)傷遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)方法，且沒有異物侵入組織；

（4）高應(yīng)用價值：可將光遺傳技術(shù)應(yīng)用到未曾可想的研究領(lǐng)域，像記憶神經(jīng)學(xué)、其他組織器官研究及臨床疾病治療等。

當(dāng)然，光遺傳學(xué)技術(shù)還并不那么完美，目前仍存在一些局限性及亟待解決的問題：

（1）第一，光刺激水平可能會導(dǎo)致神經(jīng)元反應(yīng)超出生理范圍，促使神經(jīng)元下游的異常激活或抑制，出現(xiàn)不自然的神經(jīng)回路響應(yīng)，從而導(dǎo)致不正確的神經(jīng)生理功能；

（2）第二，光照和光敏蛋白的表達(dá)可能并不統(tǒng)一在目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞群中，導(dǎo)致光遺傳學(xué)操作的幅度和空間范圍產(chǎn)生異質(zhì)性。例如光照在細(xì)胞表面產(chǎn)生散射，影響到附近非目標(biāo)神經(jīng)元；

（3）第三，對目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞群進行大量且精確的刺激，有可能會促進神經(jīng)回路進入非生理活動狀態(tài)；

（4）第四，長期過表達(dá)外源性光敏蛋白造成軸突形態(tài)異常，是否會對神經(jīng)環(huán)路產(chǎn)出潛在的影響，仍需要實驗進一步仔細(xì)評估。

?????? 那么，光遺傳學(xué)技術(shù)在研究中如何應(yīng)用呢？小編整理了幾個文獻(xiàn)案例來跟大家分享下。

應(yīng)用案例：

ChR2(H134R)—神經(jīng)

文章標(biāo)題：Transient, Consequential Increases in Extracellular Potassium Ions Accompany Channelrhodopsin2 Excitation【Cell Rep. IF=8.109，AAV，神經(jīng)】

載體：AAV2/5- GfaABC1D-ChR2(H134R)-mCherry；AAV2/5- hsyn-ChR2(H134R)-YFP

病毒滴度：AAV2/5- GfaABC1D-ChR2(H134R)-mCherry（8.1×10^12 gc/ml）；AAV2/5- hsyn-ChR2(H134R)-YFP（2.9×10^12 gc/ml）

注射體積：1μl，200nl/min

注射部位：背外側(cè)紋狀體，淺表運動皮層

注射方式：腦立體定位注射

操作方法：473nm藍(lán)光激活ChR2(H134R)，藍(lán)光間隔10s照射10s，，持續(xù)60min

觀察方式：選擇性K+微電極，紋狀體急性切片，小鼠行為學(xué)觀察。

圖1. AAV-ChR2表達(dá)后出現(xiàn)細(xì)胞外K+的短暫增加

ChR2(H134R)—心臟

發(fā)表文章：Optical Manipulation of Perfused Mouse Heart Expressing Channelrhodopsin-2 in Rhythm Control【Methods Mol Biol. IF=38.31，AAV，心臟】

載體：pAAV-CAG-hChR2(H134R)-mCherry

病毒滴度：1×1013 VG/mL

注射體積：150μl，共2.5×1012 gc

感染部位：小鼠心臟

注射方式：頸靜脈注射

操作方法：473nm藍(lán)光激活ChR2(H134R),強度5.52mW/mm2，10Hz持續(xù)20ms等。

觀察方式：離體心臟，心臟WPI電極記錄心臟MAP等。

圖2. 小鼠離體心臟光刺激示意圖以及心臟活動記錄

C1V1

發(fā)表文章：Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction【Nature. IF=42.778，AAV，神經(jīng)】

載體：rAAV5-CaMKIIaC1V1(E122T/E162T)-TS-mCherry

病毒滴度：(1.0-2.0)×1012 VG/mL

注射體積：600 nL

注射部位：小鼠皮質(zhì)及丘腦

注射方式：腦立體定位注射

操作方法：561 nm黃光激活C1V1(t/t)，強度2 ms，2-3 mW，5 Hz，間隔20 ms，持續(xù)時間100 ms。

觀察方式：免疫熒光、膜片鉗電生理等。

圖3. AAV介導(dǎo)C1V1(t/t)在前額錐體神經(jīng)元中表達(dá)

ChETA和Arch

發(fā)表文章：Hypothalamic feedforward inhibition of thalamocortical network controls arousal and?consciousness【Nature Neuroscience. IF=20.071，AAV，神經(jīng)】

載體：AAVdj-ChETA-EYFP；AAV2-DIO-ArchT-EYFP

病毒滴度：＞1.0×1012 VG/mL

注射體積：600 nL

注射部位：小鼠丘腦

注射方式：腦立體定位注射

操作方法：473 nm藍(lán)光激活ChETA，強度5 ms，25-30 mW，1/5/20 Hz，持續(xù)時間10s；593 nm黃光激活A(yù)rchT，強度5 s，25-30 mW，1/20Hz，無間隔，持續(xù)時間5s。

觀察方式：免疫熒光、膜片鉗電生理等。

圖4. AAV-DIO-ChETA體內(nèi)感染LHGABA神經(jīng)元

圖5. AAVdj-DIO-ArchT-YFP在體內(nèi)感染TRNGABA神經(jīng)元

eNpHR3.0 ?

發(fā)表文章：Brief, but not prolonged, pauses in the firing of midbrain dopamine neurons are sufficient to produce a conditioned inhibitor【Journal of Neuroscience. IF=5.673，AAV，神經(jīng)】

載體：AAV5-EF1α-DIO-NpHR3.0-eYFP

病毒滴度：＞1.0×1012 VG/mL

注射體積：1-1.5 μL

注射部位：大鼠中腦VTA區(qū)

注射方式：腦立體定位注射

操作方法：532 nm綠光激活NpHR3.0，強度16-18 mW，1.5s，4–20 kHz，間隔1 s，持續(xù)時間140s。

觀察方式：免疫熒光、離體腦切片等。

圖6. AAV介導(dǎo)eNpHR3.0-eYFP在VTA中TH陽性神經(jīng)元中表達(dá)

以上便是一些常見光敏蛋白的應(yīng)用，可見光遺傳學(xué)不僅是調(diào)控神經(jīng)元活動的有效方法，也可以運用到心臟等其他器官中，延申應(yīng)用也有待進一步發(fā)展，并且是發(fā)表高質(zhì)量文章的必備工具，大家若有相關(guān)方面的需求，歡迎與漢恒咨詢聯(lián)系~

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參考文獻(xiàn)：

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