·?PI單染色法

1.?收集細(xì)胞｛數(shù)目約（1~ 5）×106個(gè)/mL｝，500 ~ 1000 r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。

2.? 3ml　PBS洗滌1次。

3.? 離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小時(shí)。

4.? 離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。

5.? 400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次，500—1000r/min離心5min，棄去PBS。

6.? 用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。

7.? 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。

8.? 結(jié)果判斷：在前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類(lèi)型有關(guān)；在分析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門(mén)技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強(qiáng)度為1.0，則一個(gè)典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45，可用雞和鮭魚(yú)的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低，或者是因?yàn)镈NA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意。

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·?Heochst 33342/PI雙染色法

1.?懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342 ，終濃度為1ug/ml； 37℃孵育7—10min。

? 2.低溫500 ~ 1000r/min離心5min棄去染液。

3.? 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

4.? 400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次。

5.? 流式細(xì)胞儀分析：Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線(xiàn)熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為352nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)為400 ~ 500nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。

6.? 結(jié)果判斷：在蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。

注意事項(xiàng)

1.? 在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見(jiàn)到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。

2.? 用Heochst 33342染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在20min之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。

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·?Annexin V/PI雙染色法

1.?細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到10ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1~5）×106，/mL　500~1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。

2.? 用孵育緩沖液洗滌1次，500~1000r/min離心5min。

3.? 用100ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10~15min。

4.? 500~1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。

5.? 加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。

6.? 流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488nm，用一波長(zhǎng)為515nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于560nm的濾器檢測(cè)PI。

7.? 結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒(méi)有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。