血漿樣本在臨床上易于獲取并且生物信息豐富，因此血漿蛋白質(zhì)組學研究受到廣泛關注。然而，血漿中的一些高豐度蛋白質(zhì)占據(jù)大量的質(zhì)譜信號從而使得低豐度蛋白質(zhì)不容易被質(zhì)譜檢測到。神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組織取樣困難，血漿或腦脊液等體液樣本都受到信號抑制的影響，導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究尤為困難。

近日，青蓮百奧CTO趙焱博士與中國人民解放軍總醫(yī)院李芮冰主任團隊合作的血漿蛋白質(zhì)組最新成果“基于納米材料蛋白冠血漿蛋白質(zhì)組學深度挖掘策略的建立及臨床應用評價”見刊《Analytica Chimica Acta》（IF=6.2）。該研究結合青蓮百奧自主研發(fā)的納米材料蛋白冠富集血漿蛋白技術（MagicOmics-DMB）、蛋白質(zhì)組學全流程自動化前處理機器人（MagicOmics-AP-96），并優(yōu)化DIA-MS檢測方法以及DIA-NN文庫檢索方法，青蓮百奧團隊開發(fā)了血漿蛋白質(zhì)組學深度挖掘策略的范式，并將該策略應用于精準醫(yī)療診療標志物的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)。

研究思路

該研究建立了血漿蛋白質(zhì)組深度挖掘策略：利用DMB磁珠富集低豐度蛋白質(zhì)，采用DIA掃描方法獲得全息質(zhì)譜，對數(shù)據(jù)進行DIA-NN處理，得到定性和定量結果。

隨后設計了一系列實驗來評估該策略的有效性：

1. DMB磁珠富集與傳統(tǒng)富集方法的定性深度和重現(xiàn)性比較：高豐度蛋白去除（2種和14種）、六肽配體富集和DMB磁珠富集處理，比較定量結果

2. 血漿和DMB磁珠不同孵育時間和消化方法的比較：不同時間（0.5、1、2和4小時）孵育，比較定量結果

3. 不同血漿加入體積富集結果比較：不同體積的血漿樣品加入等體積的DMB磁珠中進行富集，比較定量結果

4. 定量結果可靠性評價：向等量的血漿中添加不同梯度的大腸桿菌蛋白混合物，檢測大腸桿菌蛋白和血漿蛋白

最后采用該策略分析了來自MSA組和健康對照組（MSA患者n=18；健康對照n = 18）的血漿樣本。

研究結果

一、蛋白鑒定深度和重復性評估

將來自同一志愿者的血漿樣本分為四部分，分別進行高豐度蛋白去除（2種和14種）、六肽配體富集和DMB磁珠富集處理。比較發(fā)現(xiàn)，DMB磁珠法顯著增加了血漿蛋白的鑒定數(shù)量，其中特有的鑒定蛋白數(shù)量達到1031個。特有蛋白的KEGG通路分析表明許多蛋白質(zhì)參與了腦疾病相關通路，包括阿爾茨海默病、帕金森病和神經(jīng)元生成通路，這為腦疾病的研究提供了更多的分析指標。DMB磁珠對不同豐度血漿蛋白的富集能力遠超過其他處理方法，在μg/L和ng/L濃度范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)上表現(xiàn)出色。而且，DMB磁珠能富集濃度相比其他方法可檢測更低數(shù)量級的蛋白。

選擇3名不同健康志愿者（2女1男）的血漿樣本用DMB磁珠富集后進行質(zhì)譜分析（3次重復），發(fā)現(xiàn)共同鑒定蛋白占每個樣本總蛋白數(shù)量的83%以上。同一樣本的3次重復中，CV<20%的蛋白占所有蛋白的87%以上。個體間差異所占蛋白質(zhì)的比例不超過總蛋白的59%。

二、不同孵育時間和酶解方法的比較

不同的孵育時間（0.5、1、2和4小時）下獲得的定量結果具有良好的相關性（r>0.9），而增加孵育時間并不會增加鑒定蛋白質(zhì)的數(shù)量。與傳統(tǒng)的酶解方法相比，DMB磁珠法可以直接在珠子上進行酶解，有效地減少了蛋白質(zhì)的損失并增加了蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量同時可以節(jié)省洗脫和轉(zhuǎn)移管的時間，可以更高效完成大隊列臨床樣本處理。

三、不同體積的血漿富集結果評估

將不同體積的血漿樣品加入等體積的DMB磁珠中進行富集，觀察富集到蛋白質(zhì)的豐度變化。所有結合蛋白的MS總峰面積隨著血漿體積的增加而逐漸增加，在血漿加入體積為1μl時達到平穩(wěn)，表明磁珠的結合位點開始飽和。隨著血漿添加量的不斷增加，具有高親和力的蛋白逐漸代替之前結合的親和力低但豐度高的蛋白，實現(xiàn)了低和中豐度蛋白的富集。當血漿體積達到50μl后，蛋白質(zhì)的數(shù)量增加減慢。

磁珠富集蛋白的質(zhì)譜檢測強度與血漿添加體積之間呈線性相關。與mg/L水平的蛋白相比，相關系數(shù)為1.0的蛋白數(shù)量較高，且濃度在μg/L和ng/L的蛋白顯示出更好的相關性。

從高豐度低親和力的蛋白質(zhì)和低豐度高親和力的蛋白質(zhì)中各選取50種蛋白質(zhì)分析長度、分子量、疏水性、等電點、脂溶指數(shù)和氨基酸數(shù)量等方面的差異，結果顯示親和力、等電點以及色氨酸和半胱氨酸殘基的數(shù)量主導了DMB磁珠的蛋白冠組成。STRING分析顯示兩類蛋白可以形成不同的網(wǎng)絡群，表明蛋白冠的形成與蛋白質(zhì)的相互作用密切相關。當高親和力蛋白被富集時，與這些蛋白有密切相互作用的蛋白也可以被同時富集。

四、低豐度蛋白定量結果的可靠性

向等量的血漿中添加不同梯度的大腸桿菌蛋白混合物，檢測大腸桿菌蛋白定量和血漿蛋白的變化，結果顯示血漿蛋白比值變化范圍在0.94-1.25中顯示出較小的波動，而大腸桿菌蛋白在比值上呈梯度變化，表明磁性材料的富集與樣品中蛋白質(zhì)的豐度有關，而不是完全無序的富集狀態(tài)。通過DMB磁珠富集，可以實現(xiàn)對血漿樣本中低豐度蛋白質(zhì)的定量比較。

五、深度挖掘策略在MSA中的應用

與沒有富集相比，富集后每個樣品鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量增加了3倍以上。差異表達蛋白將MSA組與健康對照組區(qū)分開。上調(diào)蛋白主要與蛋白磷酸化、抗菌肽和肽酶活性以及免疫應答等相關。下調(diào)蛋白與肌動蛋白和血腦屏障功能的維護有關，這與疾病的表型特征相一致。免疫和腦疾病相關差異蛋白在血漿中濃度很低，通常只能通過腦脊液檢測到，現(xiàn)在可以通過磁性材料的富集技術來檢測和定量。對與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關或在腦組織中特異性表達的關鍵蛋白ENPP2、BNDF和SLC2A1/Glut1的ELISA驗證結果與質(zhì)譜結果一致。

研究總結

該研究的血漿深度挖掘策略提高了血漿蛋白質(zhì)組的檢測深度，同時在樣品富集方面具有良好的穩(wěn)定性，同時在節(jié)省時間和減少損失方面具有一定優(yōu)勢。將該策略應用于MSA疾病標志物發(fā)現(xiàn)中，鑒定出18種與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關或腦組織特異性表達的差異蛋白，并交叉驗證了ENPP2和SLC2A1/Glut1蛋白的ELISA結果，證明了臨床生物標志物研究的可行性。