懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法: 以淋巴細(xì)胞為例

根據(jù)血液中各種細(xì)胞的比重不同，在血液中加入淋巴細(xì)胞分離液，通過(guò)離心法，可是一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度進(jìn)行分布，通常會(huì)分為4層，從上至下依次為血漿層、淋巴細(xì)胞層、分離液層、紅細(xì)胞層（見(jiàn)圖1）。

具體步驟：

1）抽取靜脈血2 mL，注含有肝素的無(wú)菌試管中搖勻，加入2 mL Hanks溶液稀釋?zhuān)?/p>

2）吸管吸取稀釋血液沿試管壁緩緩加到含有2 mL淋巴細(xì)胞分離液的試管中（血液:Hanks液:淋巴細(xì)胞分離液的比例為1:1:1）；

3）水平式離心2000 r/min×20 min；

4）用平口吸管小心吸取中層呈白色霧狀的細(xì)胞層，用Hanks溶液洗滌兩次，每次離心1500 r/min×10 min；

5）棄上清，加RPMI-1640培養(yǎng)液1 mL混勻，取少許進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定；

6）貼壁法區(qū)分單核細(xì)胞（易貼壁）和淋巴細(xì)胞。

注意事項(xiàng)：

1）血液樣本須在抽取2小時(shí)內(nèi)使用；

2）注意將稀釋后的血輕輕地沿管壁鋪在聚蔗糖液面上，避免破壞其界面；

3）在收集單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞時(shí)，將吸管輕輕插入該層后，沿管壁輕輕旋轉(zhuǎn)吸取細(xì)胞。

組織塊培養(yǎng)法：以大鼠肺成纖維細(xì)胞為例

具體步驟：

1）鋪瓶：乳大鼠經(jīng)頸動(dòng)脈放血后，無(wú)菌操作取肺臟組織，置于含Hanks液的平皿中漂洗3次，將血凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，將肺臟組織剪成約1 mm2大小碎片，均勻鋪在瓶底，25 mL培養(yǎng)瓶可接種20~30小塊；

2）輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后于瓶?jī)?nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞，將瓶?jī)A斜放置在37℃溫箱內(nèi)；待其稍干燥后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)；

3）培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放，開(kāi)始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長(zhǎng)，培養(yǎng)3~5天時(shí)可換液，在第7-9天便開(kāi)始有細(xì)胞從組織塊周?chē)莱觥?/p>

具體步驟：

1）無(wú)菌條件下取正常分娩胎兒的新鮮臍帶，用PBS沖洗臍帶至無(wú)血色液體流出。

2）從臍靜脈一端注入0.1%的Ⅱ型膠原酶溶液，夾閉臍帶兩端，置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化。15 min后，收集消化液，并加入含20％胎牛血清的M199培養(yǎng)基終止消化，注入M199培養(yǎng)基反復(fù)灌洗臍帶，收集沖洗液，與消化液一起1000 rpm離心5 min；

3）棄上清液，加入M199培養(yǎng)液（含20%胎牛血清、100 ng/ml VEGF），吹打，使細(xì)胞重懸，移入培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)；

4）24 h后換液，以后每隔3天換液一次，約7天左右細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)匯合，可以傳代；

5）使用前可使用標(biāo)記因子CD31或VIII因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

以上實(shí)驗(yàn)中涉及的PBS緩沖液以及RPMI-1640、M199培養(yǎng)基等，環(huán)凱均有銷(xiāo)售，詳情見(jiàn)下圖。

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