脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時形成的脂質(zhì)雙分子層，又稱為人工生物膜。陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA—脂復(fù)合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體。其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放，并進入細胞質(zhì)中，再進一步進入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達。

Lipo2000是最常見的廣譜脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，以其操作簡單、轉(zhuǎn)染效率高、對細胞毒性較低等優(yōu)點，在各大高校實驗室、研究所等都得到廣泛的使用。下面將以24孔板對應(yīng)用量為例，簡單介紹DNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的操作方法。

1.?實驗用品

1.1 主要試劑：

Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent （Invitrogen 11668019）

Opti-MEM? I Reduced Serum Medium（Gibco 31985-062）

1.2 主要耗材：
無菌槍頭，一次性移液管，1.5mL EP管，15 mL離心管，細胞計數(shù)板，24孔板

2.實驗操作

2.1?細胞準(zhǔn)備

1) 貼壁細胞：轉(zhuǎn)染前一天，在500μL無抗生素的培養(yǎng)基中接種細胞，約0.5-2×105個/孔。

2) 懸浮細胞：轉(zhuǎn)染前一天，在500μL無抗生素的培養(yǎng)基中接種細胞，約4-8×105個/孔。

2.2?DNA—脂復(fù)合體配制

1) 準(zhǔn)備兩支1.5mL EP管（標(biāo)記管1和管2），加入50μL Opti-MEM? I 低血清培養(yǎng)基（如無，可使用其他無血清培養(yǎng)基代替）。

2) 取1 μg目的質(zhì)粒（DNA），加入管1稀釋，輕輕混勻。

3) 充分吹打混勻Lipofectamine? 2000原液管，按照DNA（μg）與Lipo（μL）添加比例1:2-1:3，取2-3μL Lipo懸液加入管2稀釋混勻，室溫下靜置5min。

4)?將管1與管2合為一管，體積為100μL，充分混合，室溫下靜置20min。

5) 小心吸取管內(nèi)的100μL復(fù)合體，緩慢滴加入待轉(zhuǎn)染的孔內(nèi)（此時孔內(nèi)細胞匯合度或細胞密度約在90%以上），輕輕搖勻并放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.3?細胞觀察及終止轉(zhuǎn)染

1)?培養(yǎng)4-6h后，觀察細胞狀態(tài)，并更換新鮮培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如貼壁細胞變圓漂浮，換液時則需收集上清中的細胞，離心后將細胞沉淀接種回孔內(nèi)。

備注：如細胞屬于較難轉(zhuǎn)染的類型，可適當(dāng)延長細胞轉(zhuǎn)染時間，不超過24h。

2) 24-48h后可觀察細胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率，并根據(jù)具體實驗要求進行后續(xù)藥篩等工作。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細胞基因編輯

以上內(nèi)容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供

服務(wù)內(nèi)容：CRISPR/Cas9細胞基因編輯　載體構(gòu)建/病毒包裝 PDO/動物模型CDX　穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株 干細胞/原代細胞 培養(yǎng)試劑盒??