釀酒酵母是酵母的一種。自古以來，它就一直用于釀酒，烘焙和釀造。據(jù)信，它最初是從葡萄皮中分離出來的人們可以將酵母看作是一些深色水果（如李子）的皮膚上白色薄膜的成分；它存在于表皮的蠟中。它是分子和細(xì)胞生物學(xué)中研究最深入的真核生物模型之一，同時(shí)也可用作基因敲除大腸桿菌（Escherichia coli）的模型細(xì)菌。它是最常見的發(fā)酵類型微生物。

磷酸甘油酸突變酶敲除突變體釀酒酵母：生長(zhǎng)調(diào)查和轉(zhuǎn)錄組分析

釀酒酵母是能夠通過糖的異生作用來激活的，使其新陳代謝可以適應(yīng)不同碳源的生長(zhǎng)，并轉(zhuǎn)變?yōu)镃2或C3碳源（乙醇，乙酸鹽或甘油）的非發(fā)酵生長(zhǎng)。研究人員研究了編碼磷酸甘油酸突變酶的糖酵解和糖異生基因GPM1缺失的反應(yīng)。先前已證明，只有當(dāng)甘油和乙醇均作為碳源存在時(shí)，帶有GPM1的非功能性拷貝的釀酒酵母菌株才能生長(zhǎng)，而添加葡萄糖顯示出強(qiáng)烈抑制生長(zhǎng)的作用。提示需要甘油來促進(jìn)糖異生，而呼吸需要乙醇。研究人員通過發(fā)酵和轉(zhuǎn)錄組分析研究了GPM1敲除突變體的生長(zhǎng)反應(yīng)。此外，研究人員將生長(zhǎng)結(jié)果與通過使用的基因組，促進(jìn)新陳代謝模型進(jìn)行模擬獲得的結(jié)果然后再進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，甘油僅需少量即可用于生長(zhǎng)。我們的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈暗示了敲除突變體的生長(zhǎng)能力嚴(yán)重受損，該突變體呈現(xiàn)出參與戊糖磷酸途徑和乙醛酸分路的基因的轉(zhuǎn)錄水平增加。這些結(jié)果表明試圖補(bǔ)償由突變體內(nèi)糖酵解/糖異生基因的缺失引起的能量失衡。

通過基于CRISPR的FDC1基因編輯能夠減少酚類異味，釀酒酵母x多種啤酒酵母

當(dāng)今的啤酒市場(chǎng)面臨著減少傳統(tǒng)啤酒風(fēng)格消費(fèi)和增加特種啤酒消費(fèi)的挑戰(zhàn)。尤其是啤酒（比爾森啤酒），其特征是清爽，獨(dú)特的香氣和味道，但非常均勻，因此很難與它們的銷售競(jìng)爭(zhēng)?，F(xiàn)在已經(jīng)提出了開發(fā)普通啤酒酵母的新變體，巴斯德酵母等夾雜著多種釀酒酵母。（Saccharomyces pastorianus）作為解決啤酒中產(chǎn)品多樣化需求的解決方案。以前通過祖先親本物種（釀酒酵母和歐亞酵母）雜交產(chǎn)生新的更大的酵母的努力產(chǎn)生了具有不同于自然生物多樣性的芳香特征的菌株。不幸的是，這些新酵母除了具有理想的特性外，還繼承了多余的特性。最值得注意的是它們的酚醛異味（POF）生產(chǎn)，這妨礙了它們?cè)诠I(yè)生產(chǎn)過程中的直接應(yīng)用。研究人員描述了一種基于CRISPR的基因編輯策略，該策略可以系統(tǒng)地，精心地引入遺傳上復(fù)雜的工業(yè)釀酒酵母菌株，桑巴酵母和FDC1基因中的自然突變。所得的順式POF變異體顯示出巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力，并使目前的大型啤酒產(chǎn)品組合多樣化。

基于CRISPR / Cas9的釀酒酵母乳出口難以捉摸的機(jī)制探索

CRISPR/Cas9的基因組編輯可快速，同時(shí)修改釀酒酵母中的多個(gè)遺傳基因座。這項(xiàng)技術(shù)被用于功能分析研究中，目的是確定迄今為止該酵母中乳酸輸出的未知機(jī)制。構(gòu)建了釀酒酵母菌株，該菌株在25個(gè)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因中缺失，包括完整的水（甘油）蛋白家族和所有已知的羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。然后用干酪乳桿菌乳酸脫氫酶（LcLDH）的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化25缺失菌株。在厭氧，葡萄糖生長(zhǎng)的分批培養(yǎng)中，該菌株的比生長(zhǎng)速率（0.15 vs. 0.25 h-1）和生物量特異性乳酸產(chǎn)生速率（0.7 vs. 2.4 mmol g生物量-1 h-1）低于LcLDH-表達(dá)參考菌株。然而，在厭氧葡萄糖有限的恒化器培養(yǎng)物中兩種菌株的比較（稀釋率0.10 h-1）顯示出相同的乳酸產(chǎn)生率。這些結(jié)果表明，盡管25個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的缺失影響了最大的生長(zhǎng)速率，但是當(dāng)以固定的生長(zhǎng)速率進(jìn)行分析時(shí)，它并不影響乳酸鹽的出口速率。

25缺失菌株為邁向“最小轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”酵母平臺(tái)邁出了第一步，該平臺(tái)可用于特異性（異源）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能分析以及代謝工程策略的評(píng)估。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

Reference

Papini M , Nookaew I , Scalcinati G , et al. Phosphoglycerate mutase knock-out mutant Saccharomyces cerevisiae: Physiological investigation and transcriptome analysis[J]. Biotechnology Journal, 2010, 5(10):1016-1027.

Mertens S , Gallone B , Steensels J , et al. Reducing phenolic off-flavors through CRISPR-based gene editing of the FDC1 gene in Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces eubayanus hybrid lager beer yeasts[J]. Plos One, 2019, 14(1).

Robert, Mans, Else-Jasmijn, et al. A CRISPR/Cas9-based exploration into the elusive mechanism for lactate export in Saccharomyces cerevisiae.[J]. FEMS yeast research, 2017.

注明 | 文章是源井生物原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明。