1 前言說明

本課題組質(zhì)粒提取主要使用的是大腸桿菌轉(zhuǎn)化細胞（DH5α），其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗主要依據(jù)產(chǎn)品說明書。

而質(zhì)粒小提、中提、大提主要是提取量的差異，由于量的差異導(dǎo)致操作有些許不同，本實驗方案是收納及歸納個人在實驗過程中的執(zhí)行方案。

2 質(zhì)粒小提

2.1實驗設(shè)備及材料信息

2.1.1 試劑盒信息

QIAGEN Plasmid Midi Kit（12143）

2.1.2 離心機信息

型號：Eppendorf 5424R

適合離心管：1.5ml/2.0ml

最大轉(zhuǎn)速：21130g/15000rpm

2.1.3 分光光度計信息

型號：NANO-ONE

序列號：YN-N01-026

輸入電壓：DC12V

生產(chǎn)公司：杭州佑寧儀器有限公司

2.2實驗操作程序

1.取2ml菌液至2ml離心管中，離心：8000g-2min-25℃，結(jié)束后棄上清

2.沉淀中加入250ul P1 buffer（從冰箱中取用，注意是否已加(RNase I and blue），并吹打至重懸混勻（吹打應(yīng)當(dāng)輕緩）

3.加入250ul P2 buffer，立即溫和顛倒混勻5-10次（溶液呈藍色），充分混勻，室溫靜置2min

4.加入350ul P3 buffer，立即溫和顛倒混勻5-10次（溶液藍色消失），靜置2min

5.離心：20000g（最大轉(zhuǎn)速）-10min-25℃，結(jié)束后將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱

6.離心：9000g（最大轉(zhuǎn)速）-30sec-25℃，棄掉收集管中的液體

7.在柱中加入500ul DW1（去蛋白），離心：9000g（最大轉(zhuǎn)速）-30sec-25℃，棄掉收集管中的液體

8.加入500ul Wash Solution，離心：9000g（最大轉(zhuǎn)速）-30sec-25℃，棄掉收集管中的液體（重復(fù)2次）

9.將空吸附柱再次離心，離心：9000g（最大轉(zhuǎn)速）-60sec-25℃

10.將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，在吸附柱膜中央加入30ul ddH2O,靜置3-5min，之后離心：9000g（最大轉(zhuǎn)速）-60s-25℃

11.使用分光光度計檢測小提濃度并做好記錄，例：質(zhì)粒完整名稱-濃度（ng/ul）-提取時間-操作者

3 質(zhì)粒中提

3.1實驗設(shè)備及材料信息

3.1.1試劑盒信息

QIAGEN Plasmid Mini Kit (12125)

3.1.2 離心機信息

型號：Eppendorf 5430R

序列號：5428EL5243

適合離心管：15ml/50ml

最大轉(zhuǎn)速：7197g

3.1.3 分光光度計信息

型號：NANO-ONE

序列號：YN-N01-026

輸入電壓：DC12V

生產(chǎn)公司：杭州佑寧儀器有限公司

3.2實驗操作程序

1.經(jīng)過大搖（培養(yǎng)基50ml）培養(yǎng)12-16h的細菌，轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中

2.離心：4℃，6000g，15min

3.離心后，棄掉培養(yǎng)基，加4ml P1 Buffer (注意是否已加RNase I and blue,4℃儲存）重懸（溫和吹打，充分混勻）

4.開始加入4ml P2 Buffer（裂解液），靜置5min（時間要求精準(zhǔn)），上下混勻或者搖勻10次（P1有顯色劑，加入P2后，則溶液變藍）

5.時間到后， 立即加入4ml P3 Buffer，停止裂解，上下混勻或者搖勻直至藍色消失，埋入冰中，靜置15min。

6.時間到后，離心：4℃，7197g（離心機最大轉(zhuǎn)速），60min

7.離心結(jié)束后，取出，用擦手紙充當(dāng)濾紙進行過濾，轉(zhuǎn)移至另一個50ml離心管（注意從沉淀側(cè)對側(cè)傾倒液體）

8.與此同時，將吸附柱放在50ml離心管上，加4ml QBT過柱子（待用）

9.步驟7過濾后的上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱（收集廢液離心管可以用舊的，減少浪費）

10.當(dāng)吸附柱無液體流出后，加入20ml QC Buffer（分兩次，每次加10ml)，與此同時，將QF Buffer放入烘箱預(yù)熱50℃

11.取15ml 離心管，用封口膜和吸附柱纏在一起（扎幾個孔），向吸附柱加入5ml QF Buffer

12.當(dāng)吸附柱無液體流出后，拆開封口膜，在離心管中加入3.5ml 異丙醇（觀察到灰白色液體層，上下顛倒混勻，后離心，異丙醇的作用是沉淀DNA）

13.離心管離心：4℃，7000g，60min,棄上清（會觀察管底側(cè)有白色斑點，即DNA沉淀）

14.向離心管中加入70% 乙醇 2ml（從冰箱里拿），4℃，7000g，30min

15.步驟14棄掉上清后，打開蓋子，待乙醇揮發(fā)干凈，加入100ul ddH2O，進行溶解（放入烤箱10min）

16.使用分光光度計測濃度，先用溶解DNA的稀釋液ddH2O作為空白對照，后吸取提取產(chǎn)物1ul 測定濃度并記錄，例：質(zhì)粒完整名稱-濃度（ng/ul）-提取時間-操作者

4 質(zhì)粒大提

4.1實驗設(shè)備及材料信息

4.1.1試劑盒信息

The EndoFree Plasmid Maxi Kit (cat. no. 12362)-QIAGEN

4.1.2 離心機信息

型號：Eppendorf 5430R

序列號：5428EL5243

適合離心管：15ml/50ml

最大轉(zhuǎn)速：7197g

4.1.3 超微量分光光度計信息

型號：NANO-ONE

序列號：YN-N01-026

輸入電壓：DC12V

生產(chǎn)公司：杭州佑寧儀器有限公司

4.2實驗操作程序

1.將搖菌200ml的菌液（12-16h）分裝轉(zhuǎn)移至50ml離心管中（管壁，蓋子做好標(biāo)記）

2.離心：4℃，6000g，15min（注意配平問題）

3.離心后，棄掉培養(yǎng)基，加10 ml P1 Buffer (注意是否已加RNase I and blue, 4℃儲存）重懸（移液槍吹打，少許振蕩混勻也行）

4.開始加入10 ml P2 Buffer（裂解液），靜置5min（時間要求精準(zhǔn)），上下混勻或者搖勻10次（P1有顯色劑，加入P2后，則溶液變藍）

5.時間到后， 立即加入4ml P3 Buffer，停止裂解，上下混勻或者搖勻直至藍色消失

6.組裝過濾管（底部蓋子旋擰過濾管）（此時推塞不要安裝）

7.將步驟5所獲全部轉(zhuǎn)移至過濾管（兩管傾斜30°左右轉(zhuǎn)移，注意不要灑出），靜置10min

8.此時，準(zhǔn)備4只50ml離心管備用（管壁，蓋子做好標(biāo)記），待步驟7靜置結(jié)束后，旋開底部蓋子，上部安裝推塞，將液體轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備OK的離心管中。

9.于步驟8過濾液體中加入2.5ml的Buffer ER（去除內(nèi)毒素），于冰上靜置30min

10. 與此同時，將吸附柱放在50ml離心管上，加4ml QBT過柱子（待用）

11.將過濾液體緩慢傾倒在吸附柱

12.當(dāng)吸附柱無液體流出后，加入60ml QC Buffer（分兩次，每次加30ml)

13. 將向吸附柱轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中，并向吸附柱中加加入15ml QN Buffer洗脫DNA

14.棄掉吸附柱，向洗脫后的液體中加入10.5ml 異丙醇（0.7倍洗脫所得液體體積）

15. 離心：4℃，7197g，60min，棄上清（注意配平問題）（會觀察管底側(cè)有白色斑點，即DNA沉淀）

16.向離心管中加入70% 乙醇 5ml（從冰箱里拿），4℃，7197g，30min，棄上清（注意不要棄掉沉淀DNA，可能會漂?。?/p>

17.打開蓋子，待乙醇揮發(fā)干凈，加入200-500ul ddH2O，進行溶解（溶解液體視沉淀DNA大小而定）

18.使用分光光度計測濃度，先用溶解DNA的稀釋液ddH2O作為空白對照，后吸取提取產(chǎn)物1ul 測定濃度并記錄，例：質(zhì)粒完整名稱-濃度（ng/ul）-提取時間-操作者