FITC（異硫氰酸熒光素）是一種熒光素衍生物?？勺鳛闊晒馓结槕?yīng)用于制備分子生物學(xué)或糖類聚合物的結(jié)合物分子，F(xiàn)ITC常用作蛋白質(zhì)或多糖的不同底物的標(biāo)記試劑。

當(dāng)FITC在堿性溶液中蛋白反應(yīng)時(shí)，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的ε-氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbmide)結(jié)合（形成硫碳氨基鍵），形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。

FITC如何標(biāo)記蛋白步驟

1制備溶于0.1M碳酸鈉緩沖液( pH 9.0 )的待標(biāo)記蛋白溶液,濃度≥2mg/ml.

2溶解FITC于無水DMSO配制成1mg/ml的溶液。

3對(duì)于1ml蛋白溶液加入50μFITC溶液,可按照每次5μ的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液;

4待所需FITC加入完畢,將反應(yīng)液于4°C避光孵育8h ;

5加入NH4CI使其終濃度至50mM , 4°C終止反應(yīng)2h ;

6加入二甲苯青至濃度0.1% ,甘油至濃度5% ;

7通過大小孔徑合適的凝膠過濾層析分離排除未被結(jié)合的FITC ,分離范圍在20,000至50,000 (球蛋白例如抗體)。待凝膠柱平衡后,將以上反應(yīng)混合波從柱頂注入，打開凝膠柱,待其全部流入柱床后,加入PBS緩沖液。

8 于4°C避光儲(chǔ)存上述偶聯(lián)物,加入0.1% ( w/v )疊氮化鈉作為-種防腐劑。若蛋白濃度較低( < 1mg/ml) , 可加入1%BSA作為-種蛋白穩(wěn)定劑。

9標(biāo)記物中熒光素和蛋白的比值( F/P )可通過測定495nm和280nm處的吸光值來鑒定, F/P應(yīng)位于0.3-1.0。小于該比例則信號(hào)太低，高于該比例則背景太高。