第九章??核酸的生物合成

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一、知識要點

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在細胞分裂過程中通過DNA的復(fù)制把遺傳信息由親代傳遞給子代，在子代的個體發(fā)育過程中遺傳信息由DNA傳遞到RNA，最后翻譯成特異的蛋白質(zhì)；在RNA病毒中RNA具有自我復(fù)制的能力，并同時作為mRNA，指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的生物合成；在致癌RNA病毒中，RNA還以逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。這種遺傳信息的流向稱為中心法則。

復(fù)制是指以原來DNA分子為模板，合成出相同DNA分子的過程；轉(zhuǎn)錄是在DNA（或RNA）分子上合成出與其核苷酸順序相對應(yīng)的RNA（或DNA）的過程；翻譯是在以rRNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白體上，以mRNA為模板，根據(jù)每三個相鄰核苷酸決定一種氨基酸的三聯(lián)體密碼規(guī)則，由tRNA運送氨基酸，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)肽鏈的過程。

（一）??DNA的生物合成

在DNA復(fù)制時，親代DNA的雙螺旋先行解旋和分開，然后以每條鏈為模板，按照堿基配對原則，在這兩條鏈上各形成一條互補鏈，這樣從親代DNA的分子可以精確地復(fù)制成2個子代DNA分子。每個子代DNA分子中，有一條鏈是從親代DNA來的，另一條則是新形成的，這叫做半保留復(fù)制。通過14N和15N標記大腸桿菌實驗證實了半保留復(fù)制。

1．復(fù)制的起始點與方向

DNA分子復(fù)制時，在親代分子一個特定區(qū)域內(nèi)雙鏈打開，隨之以兩股鏈為模板復(fù)制生成兩個子代DNA雙鏈分子。開始時復(fù)制起始點呈現(xiàn)一叉形（或Y形），稱之為復(fù)制叉。DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開始，此特定部位稱為復(fù)制起始點（origin of replication），可以用ori表示。在原核生物中復(fù)制起始點常位于染色體的一個特定部位，即只有一個起始點。真核生物的染色體是在幾個特定部位上進行DNA復(fù)制的，有幾個復(fù)制起始點的。酵母基因組與真核生物基因組相同，具有多個復(fù)制起始點。

復(fù)制的方向可以有三種不同的機制。其一是從兩個起始點開始，各以相反的單一方向生長出一條新鏈，形成兩個復(fù)制叉。其二是從一個起始點開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個復(fù)制叉。其三是從一個起始點開始，沿兩個相反的方向各生長出兩條鏈，形成兩個復(fù)制叉。

2．DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶及相關(guān)蛋白因子

DNA的合成是以四種三磷酸脫氧核糖核苷為底物的聚合反應(yīng)，該過程除了需要酶的催化之外，還需要適量的DNA為模板，RNA（或DNA）為引物和鎂離子的參與。催化這個反應(yīng)的酶也有多種：DNA聚合酶、RNA引物合成酶（即引發(fā)酶）、DNA連接酶、拓撲異構(gòu)酶、解螺旋酶及多種蛋白質(zhì)因子參與。

3．DNA的復(fù)制過程

DNA的復(fù)制按一定的規(guī)律進行，雙螺旋的DNA是邊解開邊合成新鏈的。復(fù)制從特定位點開始，可以單向或雙向進行，但是以雙向復(fù)制為主。由于DNA雙鏈的合成延伸均為5′→3′的方向，因此復(fù)制是以半不連續(xù)的方式進行，即其中一條鏈相對地連續(xù)合成，稱之為領(lǐng)頭鏈，另一條鏈的合成是不連續(xù)的，稱為隨后鏈。在DNA復(fù)制叉上進行的基本活動包括雙鏈的解開；RNA引物的合成；DNA鏈的延長；切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段。

（二）逆向轉(zhuǎn)錄

在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反，故稱為逆向轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄酶需要以RNA（或DNA）為模板，以四種dNTP為原料，要求短鏈RNA（或DNA）作為引物，此外還需要適當濃度的二價陽離子Mg2+和Mn2+，沿5′→3′方向合成DNA，形成RNA-DNA雜交分子（或DNA雙鏈分子）。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它除了具有以RNA為模板的DNA聚合酶和以DNA為模板的DNA聚合酶活性外還兼有RNaseH、DNA內(nèi)切酶、DNA拓撲異構(gòu)酶、DNA解鏈酶和tRNA結(jié)合的活性。

幾乎所有真核生物的mRNA分子的3′末端都有一段多聚腺苷酸。當加入寡聚dT作引物時，mRNA就可以成為逆轉(zhuǎn)錄酶的模板，在體外合成與其互補的DNA，稱為cDNA。

（三）DNA突變

DNA突變??是指DNA的堿基順序發(fā)生突然而永久性地變化，從而影響DNA的復(fù)制，并使DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯也跟著改變，表現(xiàn)出異常的遺傳特征。DNA的突變可以有幾種形式：（1）一個或幾個堿基對被置換；（2）插入一個或幾個堿基對；（3）一個或多個堿基對缺失。置換和插入的變化是可逆的，缺失則是不可逆的。最常見的突變形式是堿基對的置換。嘌呤堿之間或嘧啶堿之間的置換稱為轉(zhuǎn)換，嘌呤和嘧啶之間的置換稱為顛換。突變有自發(fā)突變和誘發(fā)突變。在DNA的合成中，自發(fā)突變的機率很低，大約每109個堿基對發(fā)生一次突變；各種RNA腫瘤病毒具有很高的自發(fā)突變頻率。誘發(fā)突變可以由物理因素或化學因素引起，物理因素如電離輻射和紫外光等均可以誘發(fā)突變?；瘜W因素的誘變，如脫氨劑和烷化試劑均可誘發(fā)突變。亞硝酸為強脫氨劑，可使腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤，鳥嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤，胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ鴮?dǎo)致堿基配對錯誤。烷化劑如硫酸二甲酯（DMS）可使鳥嘌呤的N7位氮原子甲基化，使之成為帶一個正電荷的季銨基團，減弱N9位上的N-糖苷鍵，至使脫氧核糖苷鍵不穩(wěn)定，發(fā)生水解而丟失嘌呤堿，以后可被其它堿基取代，或引起DNA的鏈斷裂。

（四）DNA損傷與修復(fù)

某些物理化學因子，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑等，都能引起生物突變和致死。因為它們均能作用于DNA，造成其結(jié)構(gòu)和功能的破壞。但細胞內(nèi)具有一系列起修復(fù)作用的酶系統(tǒng)，可以除去DNA上的損傷，恢復(fù)DNA的正常雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)知道有四種修復(fù)系統(tǒng)：光復(fù)活，切除修復(fù)，重組修復(fù)和誘導(dǎo)修復(fù)。后三種機制不需要光照，因此又稱為暗修復(fù)。

1．光復(fù)活

光復(fù)活的機制是可見光（最有效波長為400nm左右）激活了光復(fù)活酶，它能分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。光復(fù)活作用是一種高度專一的修復(fù)方式。

2．切除修復(fù)

又稱為復(fù)制前修復(fù)。所謂切除修復(fù)，即是在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過程。這是比較普遍的一種修復(fù)機制，它對多種損傷均能起修復(fù)作用。參與切除修復(fù)的酶主要有：特異的核酸內(nèi)切酶、外切酶、聚合酶和連接酶。

3．重組修復(fù)

遺傳信息有缺損的子代DNA分子可通過遺傳重組而加以彌補，即從完整的母鏈上將相應(yīng)核苷酸序列片段移至子鏈缺口處，然后用再合成的序列來補上母鏈的空缺。此過程稱為重組修復(fù)，因為發(fā)生在復(fù)制之后，又稱為復(fù)制后修復(fù)。

參與重組修復(fù)的酶系統(tǒng)包括與重組有關(guān)的主要酶類以及修復(fù)合成的酶類。重組基因rec A編碼的蛋白質(zhì)，具有交換DNA鏈的活力。rec A蛋白被認為在DNA重組和重組修復(fù)中均起著關(guān)鍵的作用。rec B和rec C基因分別編碼核酸外切酶V的兩個亞基，該酶亦為重組和重組修復(fù)所必需。修復(fù)合成時需要DNA聚合酶和連接酶。

4．誘導(dǎo)修復(fù)

許多能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS response）。SOS反應(yīng)包括誘導(dǎo)出現(xiàn)的DNA損傷修復(fù)效應(yīng)、誘變效應(yīng)、細胞分裂的抑制以及溶原性細菌釋放噬菌體等等。

（五）RNA的生物合成

以DNA的一條鏈為模板在RNA聚合酶催化下，以四種核糖核苷磷酸為底物按照堿基配對原則，形成3′→5′磷酸二酯鍵，合成一條與DNA鏈的一定區(qū)段互補的RNA鏈的過程稱為轉(zhuǎn)錄。RNA的轉(zhuǎn)錄起始于DNA模板的一個特定位點，并在另一位點處終止。在生物體內(nèi)，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，這稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。用作模板的鏈稱為反義鏈，另一條鏈稱為有義鏈，因為有義鏈的脫氧核苷酸序列正好與轉(zhuǎn)錄出的RNA的核苷酸序列相同（只是T與U的區(qū)別），所以也稱編碼鏈。但各個基因的有義鏈不一定位于同一條DNA鏈。RNA的合成沿5′→3′方向進行（DNA模板鏈方向為3′→5′），5′未端為核糖核苷三磷酸，即5′位保留PPP。

在真核生物細胞里，轉(zhuǎn)錄是在細胞核內(nèi)進行的。合成的RNA包括mRNA、rRNA和tRNA的前體。rRNA的合成發(fā)生在核仁內(nèi)，而合成mRNA和tRNA的酶則定位在核質(zhì)中。另外葉綠體和線粒體也進行轉(zhuǎn)錄。原核細胞中轉(zhuǎn)錄酶類存在于細胞液中。

1．RNA聚合酶

原核細胞大腸桿菌的RNA聚合酶研究的較深入。這個酶的全酶由5種亞基（α2ββ′δω）組成，還含有2個Zn原子。在RNA合成起始之后，δ因子便與全酶分離。不含δ因子的酶仍有催化活性，稱為核心酶。δ亞基具有與啟動子結(jié)合的功能，β亞基催化效率很低，而且可以利用別的DNA的任何部位作模板合成RNA。加入δ因子后，則具有了選擇起始部位的作用，δ因子可能與核心酶結(jié)合，改變其構(gòu)象，從而使它能特異地識別DNA模板鏈上的起始信號。

真核細胞的細胞核內(nèi)有RNA聚合酶I、II和III，通常由4～6種亞基組成，并含有Zn2+。RNA聚合酶I存在于核仁中，主要催化rRNA前體的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ存在于核質(zhì)中，分別催化mRNA前體和小分子量RNA的轉(zhuǎn)錄。此外線粒體和葉綠體也含有RNA聚合酶，其特性類似原核細胞的RNA聚合酶。

2．RNA的轉(zhuǎn)錄過程

RNA轉(zhuǎn)錄過程為起始位點的識別、起始、延伸、終止。

起始位點的識別：RNA聚合酶先與DNA模板上的特殊啟動子部位結(jié)合，σ因子起著識別DNA分子上的起始信號的作用。在σ亞基作用下幫助全酶迅速找到啟動子，并與之結(jié)合生成較松弛的封閉型啟動子復(fù)合物。這時酶與DNA外部結(jié)合，識別部位大約在啟動子的-35位點處。接著是DNA構(gòu)象改變活化，得到開放型的啟動子復(fù)合物，此時酶與啟動子緊密結(jié)合，在-10位點處解開DNA雙鏈，識別其中的模板鏈。由于該部位富含A-T堿基對，故有利于DNA解鏈。開放型復(fù)合物一旦形成，DNA就繼續(xù)解鏈，酶移動到起始位點。

3．起始：在起始位點的全酶結(jié)合第一個核苷三磷酸。第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP。形成的啟動子、全酶和核苷三磷酸復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物，第一個核苷酸摻入的位置稱為轉(zhuǎn)錄起始點。這時σ亞基被釋放脫離核心酶。

4．延伸：從起始到延伸的轉(zhuǎn)變過程，包括σ因子由締合向解離的轉(zhuǎn)變。DNA分子和酶分子發(fā)生構(gòu)象的變化，核心酶與DNA的結(jié)合松弛，核心酶可沿模板移動，并按模板序列選擇下一個核苷酸，將核苷三磷酸加到生長的RNA鏈的3′-OH端，催化形成磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄延伸方向是沿DNA模板鏈的3′→5′方向按堿基酸對原則生成5′→3′的RNA產(chǎn)物。RNA鏈延伸時，RNA聚合酶繼續(xù)解開一段DNA雙鏈，長度約17個堿基對，使模板鏈暴露出來。新合成的RNA鏈與模板形成RNA-DNA的雜交區(qū)，當新生的RNA鏈離開模板DNA后，兩條DNA鏈則重新形成雙股螺旋結(jié)構(gòu)。

4．終止??在DNA分子上有終止轉(zhuǎn)錄的特殊堿基順序稱為終止子（terminators），它具有使RNA聚合酶停止合成RNA和釋放RNA鏈的作用。這些終止信號有的能被RNA聚合酶自身識別，而有的則需要有ρ因子的幫助。ρ因子是一個四聚體蛋白質(zhì)，它能與RNA聚合酶結(jié)合但不是酶的組分。它的作用是阻RNA聚合酶向前移動，于是轉(zhuǎn)錄終止，并釋放出已轉(zhuǎn)錄完成的RNA鏈。對于不依賴于ρ因子的終止子序列的分析，發(fā)現(xiàn)有兩個明顯的特征：即在DNA上有一個15～20個核苷酸的二重對稱區(qū)，位于RNA鏈結(jié)束之前，形成富含G-C的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。接著有一串大約6個A的堿基序列它們轉(zhuǎn)錄的RNA鏈的末端為一連串的U。寡聚U可能提供信號使RNA聚合酶脫離模板。在真核細胞內(nèi)，RNA的合成要比原核細胞中的復(fù)雜得多。

（六）轉(zhuǎn)錄后加工

在轉(zhuǎn)錄中新合成的RNA往往是較大的前體分子，需要經(jīng)過進一步的加工修飾，才轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩飳W活性的、成熟的RNA分子，這一過程稱為轉(zhuǎn)錄后加工。主要包括剪接、剪切和化學修飾。

1．mRNA的加工??在原核生物中轉(zhuǎn)錄翻譯相隨進行，多基因的mRNA生成后，絕大部分直接作為模板去翻譯各個基因所編碼的蛋白質(zhì)，不再需要加工。但真核生物里轉(zhuǎn)錄和翻譯的時間和空間都不相同，mRNA的合成是在細胞核內(nèi)，而蛋白質(zhì)的翻譯是在胞質(zhì)中進行，而且許多真核生物的基因是不連續(xù)的。不連續(xù)基因中的插入序列，稱為內(nèi)含子；被內(nèi)含子隔開的基因序列稱為外顯子。一個基因的外顯子和內(nèi)含子都轉(zhuǎn)錄在一條很大的原初轉(zhuǎn)錄本RNA分子中,故稱為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA）。它們首先降解為分子較小的RNA，再經(jīng)其它修飾轉(zhuǎn)化為mRNA。真核細胞mRNA的加工包括：（1）hnRNA被剪接，除去由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄來的序列，將外顯子的轉(zhuǎn)錄序列連接起來。（2）在3′末端連接上一段約有20～200個腺苷酸的多聚腺苷酸（poly A）的“尾巴”結(jié)構(gòu)。不同mRNA的長度有很大差異。（3）在5′末端連接上一個“帽子”結(jié)構(gòu)m7GpppmNP。（4）在內(nèi)部少數(shù)腺苷酸的腺嘌呤6位氨基發(fā)生甲基化（m6A）.

2．tRNA的加工??原核生物的tRNA基因的轉(zhuǎn)錄單元大多數(shù)是多基因的。不但相同或不同的tRNA的幾個基因可轉(zhuǎn)錄在一條RNA中，有的tRNA還與rRNA組成轉(zhuǎn)錄單元，因此tRNA前體的加工過程包括剪切、剪接，在3′-末端添加CCAOH、以及核苷酸修飾轉(zhuǎn)化為成熟的tRNA。tRNA中含有許多稀有堿基，所有這些堿基均是在轉(zhuǎn)錄后由四種常見堿基經(jīng)修飾酶催化，發(fā)生脫氨、甲基化、羥基化等化學修飾而生成的。

3．rRNA的加工??原核細胞首先生成的是30S前體rRNA，經(jīng)核糖核酸酶作用，逐步裂解為16S、23S和5S的rRNA，其裂解過程可歸納如下：

原核生物16S rRNA和23S rRNA含有較多的甲基化修飾成分，特別是2-甲基核糖。一般5S rRNA中無修飾成分。在真核細胞中rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工與原核細胞類似，但更為復(fù)雜。rRNA在核仁中合成，生成一個更大35～45S前體rRNA。前體分裂而轉(zhuǎn)變?yōu)?8S、18S和5.8S的rRNA分子。真核生物5S rRNA前體是由獨立于上述三種rRNA之外的基因轉(zhuǎn)錄的。真核生物rRNA中與含有較多的甲基化成分。

有關(guān)RNA剪接、剪切機制的研究不僅發(fā)現(xiàn)了RNA分子本身具有催化功能，這種具有剪接功能的RNA催化劑命名為核酶。目前已發(fā)現(xiàn)的具有催化功能的RNA有磷酸二酯酶（核糖核酸酶）、磷酸單酯酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、RNA限制性內(nèi)切酶、?tRNA 5′端成熟酶、α-1,4-葡聚糖分支酶和肽基轉(zhuǎn)移酶等。目前研究表明核酶催化rRNA、tRNA、mRNA的剪接機理是不相同的。RNA內(nèi)含子有四種類型，即Ⅰ型自我拼接內(nèi)含子、Ⅱ型自我拼接內(nèi)含子、核mRNA內(nèi)含子和核tRNA內(nèi)含子。

（七）RNA的復(fù)制

大多數(shù)生物的遺傳信息貯藏的DNA中，遺傳信息按中心法則由DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA，?再由RNA翻譯成蛋白質(zhì)的。對RNA病毒的研究表明，某些RNA病毒是以RNA作模板復(fù)制出病毒RNA分子。

Qβ噬菌體RNA的復(fù)制可分為兩個階段：（1）當Qβ噬菌體侵染大腸桿菌細胞后，其單鏈RNA充當mRNA，利用宿主細胞中的核糖體合成噬菌體外殼蛋白質(zhì)和復(fù)制酶β亞基；（2）當復(fù)制酶的β亞基和宿主細胞原有的α、γ、δ亞基自動裝配成RNA復(fù)制酶以后，就進行RNA復(fù)制。以侵染的噬菌體RNA作模板，通過RNA復(fù)制酶合成互補的RNA鏈。常把具有mRNA功能的鏈稱為正鏈，與它互補的鏈稱為負鏈。在噬菌體特異的復(fù)制酶裝配好后不久酶就吸附到正鏈RNA的3′末端，以它為模板合成出負鏈，至合成結(jié)束，然后負鏈從正鏈模板上釋放出來。同一個酶又吸附到負鏈RNA的3′末端，合成出病毒正鏈RNA，正鏈RNA與外殼蛋白裝配成噬菌體顆粒，所以正鏈和負鏈的合成方向都是由5′→3′。

（八）基因工程的操作技術(shù)

1．目的基因

體外操作DNA的主要步驟之一是提取載體DNA和所需要的外源目的基因。在細胞中DNA并非以游離態(tài)分子存在，而是和RNA及蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成復(fù)合體。DNA純化的基本步驟是：（1）從破壞的細胞壁和膜里釋放出可溶性的DNA；（2）通過變性或蛋白質(zhì)分解，使DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合體解離；（3）將DNA從其它大分子中分離出來；（4）DNA濃度和純度的光學測定。

2．載體

外源DNA片段（目的基因）要進入受體細胞，必須有一個適當?shù)倪\載工具將帶入細胞內(nèi)，并載著外源DNA一起進行復(fù)制與表達，這種運載工具稱為載體。

載體必須具備下列條件：（1）在受體細胞中，載體可以獨立地進行復(fù)制。所以載體本身必須是一個復(fù)制單位，稱復(fù)制子（replicon），具有復(fù)制起點。而且插入外源DNA后不會影響載體本身復(fù)制的能力。（2）易于鑒定、篩選。也就是說，容易將帶有外源DNA的重組體與不帶外源DNA的載體區(qū)別開來。（3）易于引入受體細胞。

常用的載體主要有以下幾類：細菌和酵母的質(zhì)粒，λ噬菌體和M13以及病毒。

3．連接 ?

外源DNA與載體DNA之間可以通過多種方式相連接，主要有以下幾種(1) 粘性末端連接；(2) 平頭末端連接；(3) 接頭連接等。

4．轉(zhuǎn)化 ?

任何外源DNA重組到載體上，然后轉(zhuǎn)入受體細胞中復(fù)制繁殖，這一過程稱為DNA的克隆。外源DNA進入受體細胞并使它獲得新遺傳特性的過程稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化作用是將外源DNA引入細胞的過程。

5．篩選??由于細胞轉(zhuǎn)化的頻率較低，所以從大量的宿主細胞中篩選出帶有重組體的細胞并不是很容易的，當前，在實驗室中，常用的篩選手段有以下幾種：(1) 插入失活；(2) 菌落原位雜交；(3) 免疫學方法．此外，對重組體轉(zhuǎn)化的鑒定還可以采用表現(xiàn)型的鑒定；對重組質(zhì)粒純化并重新轉(zhuǎn)化；限制性酶切圖譜的繪制；重組質(zhì)粒上的基因定位等更深入的方法。

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二、習??題

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（一）名詞解釋

1．半保留復(fù)制（semiconservative replication）

2．不對稱轉(zhuǎn)錄（asymmetric trancription）

3．逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）

4．岡崎片段（Okazaki fragment）

5．復(fù)制叉（replication fork）

6．領(lǐng)頭鏈（leading strand）

7．隨后鏈（lagging strand）

8．有意義鏈（sense strand）

9．光復(fù)活（photoreactivation）

10．重組修復(fù)（recombination repair）

11．內(nèi)含子（intron）

12．外顯子（exon）

13．基因載體（genonic vector）???

14．質(zhì)粒（plasmid）

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（二）填空題

1．DNA復(fù)制是定點雙向進行的，?????股的合成是?????，并且合成方向和復(fù)制叉移動方向相同；?????股的合成是?????的，合成方向與復(fù)制叉移動的方向相反。每個岡崎片段是借助于連在它的?????末端上的一小段?????而合成的；所有岡崎片段鏈的增長都是按?????方向進行。

2．DNA連接酶催化的連接反應(yīng)需要能量，大腸桿菌由?????供能，動物細胞由?????供能。

3．大腸桿菌RNA聚合酶全酶由?????組成；核心酶的組成是?????。參與識別起始信號的是?????因子。

4．基因有兩條鏈，作為模板指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的那條鏈稱?????鏈。

5．以RNA為模板合成DNA稱?????，由?????酶催化。

6．DNA或UpGpCpA分別經(jīng)0.3NKOHR、NaseT1和牛胰RNaseI處理所得結(jié)果：

DNA: 0.3NKOH：???????；RNaseT1：???????；RNase I：???????;

UpGpCpA：0.3NKOH：????????；RNaseT1：????????；RNase I ：????????。

7．基因突變形式分為：?????，?????，?????和?????四類。

8．亞硝酸是一個非常有效的誘變劑，因為它可直接作用于DNA，使堿基中?????基氧化成?????基，造成堿基對的?????。

9．所有岡崎片段的延伸都是按??????方向進行的。

10．前導(dǎo)鏈的合成是??????的，其合成方向與復(fù)制叉移動方向??????；隨后鏈的合成是??????的，其合成方向與復(fù)制叉移動方向??????。

11．引物酶與轉(zhuǎn)錄中的RNA聚合酶之間的差別在于它對??????不敏感，并可以???????作為底物。

12．DNA聚合酶I的催化功能有?????、?????、?????、?????和?????。

13．DNA回旋酶又叫?????，它的功能是?????。

14．細菌的環(huán)狀DNA通常在一個?????開始復(fù)制，而真核生物染色體中的線形DNA可以在?????起始復(fù)制。

15．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的?????活性使之具有?????功能，極大地提高了DNA復(fù)制的保真度。

16．大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn)?????種DNA聚合酶，其中?????負責DNA復(fù)制，?????負責DNA損傷修復(fù)。

17．DNA切除修復(fù)需要的酶有?????、?????、?????和?????。

18．在DNA復(fù)制中，?????可防止單鏈模板重新締合和核酸酶的攻擊。

19．DNA合成時，先由引物酶合成?????，再由?????在其3′?端合成DNA鏈，然后由?????切除引物并填補空隙，最后由?????連接成完整的鏈。

20．原核細胞中各種RNA是?????催化生成的，而真核細胞核基因的轉(zhuǎn)錄分別由?????種RNA聚合酶催化，其中rRNA基因由?????轉(zhuǎn)錄，hnRNA基因由?????轉(zhuǎn)錄，各類小分子量RAN則是?????的產(chǎn)物。

21．一個轉(zhuǎn)錄單位一般應(yīng)包括?????序列、?????序列和?????順序。

22．真核細胞中編碼蛋白質(zhì)的基因多為?????。編碼的序列還保留在成熟mRNA中的是?????，編碼的序列在前體分子轉(zhuǎn)錄后加工中被切除的是?????。在基因中?????被

??????分隔，而在成熟的mRNA序列被拼接起來。

23．染色質(zhì)中的?????蛋白和?????蛋白對轉(zhuǎn)錄均有調(diào)節(jié)作用，其中?????的調(diào)節(jié)作用具有組織特異性。

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（三）選擇題

1．DNA按半保留方式復(fù)制。如果一個完全放射標記的雙鏈DNA分子，放在不含有放射標記物的溶液中，進行兩輪復(fù)制，所產(chǎn)生的四個DNA分子的放射活性將會怎樣：

A．半數(shù)分子沒有放射性????????????B．所有分子均有放射性

C．半數(shù)分子的兩條鏈均有放射性????D．一個分子的兩條鏈均有放射性

E．四個分子均無放射性

2．參加DNA復(fù)制的酶類包括：（1）DNA聚合酶Ⅲ；（2）解鏈酶；（3）DNA聚合酶Ⅰ；（4）RNA聚合酶（引物酶）；（5）DNA連接酶。其作用順序是：

A．（4）、（3）、（1）、（2）、（5）??????B．（2）、（3）、（4）、（1）、（5）

C．（4）、（2）、（1）、（5）、（3）??????D．（4）、（2）、（1）、（3）、（5）

E．（2）、（4）、（1）、（3）、（5）

3．如果15N標記的大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N培養(yǎng)基中生長了三代，其各種狀況的DNA分子比例應(yīng)是下列哪一項：

4．下列關(guān)于DNA復(fù)制特點的敘述哪一項錯誤的：

A．RNA與DNA鏈共價相連???????B．新生DNA鏈沿5′→3′方向合成

C．DNA鏈的合成是不連續(xù)的??????D．復(fù)制總是定點雙向進行的

E．DNA在一條母鏈上沿5′→3′方向合成，而在另一條母鏈上則沿3′→5′方向合成?

5．DNA復(fù)制時，?5′—TpApGpAp－3′序列產(chǎn)生的互補結(jié)構(gòu)是下列哪一種：

A．5′—TpCpTpAp－3′????????????B．5′—ApTpCpTp－3′

C．5′—UpCpUpAp－3′????????????????????????????????D．5′—GpCpGpAp－3′??

E．3′???????????—TpCpTpAp－5′

6．下列關(guān)于DNA聚合酶I的敘述哪一項是正確的：

A．它起DNA修復(fù)酶的作用但不參加DNA復(fù)制過程

B．它催化dNTP聚合時需要模板和引物

C．在DNA復(fù)制時把岡崎片段連接成完整的隨從鏈

D．它催化產(chǎn)生的岡崎片段與RNA引物鏈相連

E．有些細菌突變體其正常生長不需要它

7．下列關(guān)于真核細胞DNA聚合酶活性的敘述哪一項是正確的：

A．它僅有一種???????????????????B它不具有核酸酶活性

C．它的底物是二磷酸脫氧核苷?????D它不需要引物

E．它按3′-5′方向合成新生鏈

8．從正在進行DNA復(fù)制的細胞分離出的短鏈核酸——岡崎片段，具有下列哪項特性：

A．它們是雙鏈的?????????????????B．它們是一組短的單鏈DNA片段

C．它們是DNA—RNA雜化雙鏈????D．它們被核酸酶活性切除

E．它們產(chǎn)生于親代DNA鏈的糖-磷酸骨架的缺口處

9．切除修復(fù)可以糾正下列哪一項引起的DNA損傷：

A．堿基缺失?????????????B．堿基插入??????????C．堿基甲基化

D．胸腺嘧啶二聚體形成???E．堿基烷基化

10．大腸桿菌DNA連接酶需要下列哪一種輔助因子？

A．FAD作為電子受體???????????????B．NADP+作為磷酸供體

C．NAD+形成活性腺苷酰酶??????????D．NAD+作為電子受體

E．以上都不是

11．下列關(guān)于RNA和DNA聚合酶的敘述哪一項是正確的：

A．RNA聚合酶用二磷酸核苷合成多核苷酸鏈

B．RNA聚合酶需要引物，并在延長鏈的5′端加接堿基

C．DNA聚合酶可在鏈的兩端加接核苷酸

D．DNA僅能以RNA為模板合成DNA

E．所有RNA聚合酶和DNA聚合酶只能在生長中的多核苷酸鏈的3′端加接核苷酸

12．紫外線照射引起DNA最常見的損傷形式是生成胸腺嘧啶二聚體。在下列關(guān)于DNA分子結(jié)構(gòu)這種變化的敘述中，哪項是正確的：

A．不會終止DNA復(fù)制

B．可由包括連接酶在內(nèi)的有關(guān)酶系統(tǒng)進行修復(fù)

C．可看作是一種移碼突變

D．是由胸腺嘧啶二聚體酶催化生成的

E．引起相對的核苷酸鏈上胸腺嘧啶間的共價聯(lián)結(jié)

13．下列哪種突變最可能是致死的：

A．腺嘌呤取代胞嘧啶??????????B．胞嘧啶取代鳥嘌呤

C．甲基胞嘧啶取代胞嘧啶??????D．缺失三個核苷酸

E．插入一個核苷酸

14．鐮刀形紅細胞貧血病是異常血紅蛋白純合子基因的臨床表現(xiàn)。β-鏈變異是由下列哪種突變造成的：

A．交換??????B．插入?????C．缺失?????D．染色體不分離?????E．點突變

15．在培養(yǎng)大腸桿菌時，自發(fā)點突變的引起多半是由于：

A．氫原子的互變異構(gòu)移位????????????B．DNA糖-磷酸骨架的斷裂

C．插入一個堿基對??????D．鏈間交聯(lián)??????E．脫氧核糖的變旋

16．插入或缺失堿基對會引起移碼突變，下列哪種化合物最容易造成這種突變：

A．口丫啶衍生物??????B．5-溴尿嘧啶

C．氮雜絲氨酸??????D．乙基乙磺酸???????E．咪唑硫嘌呤

17．在對細菌DNA復(fù)制機制的研究中，常常用到胸腺嘧啶的類似物5-溴尿嘧啶，其目的在于：

A．引起特異性移碼突變以作為順序研究用

B．在胸腺嘧啶參入部位中止DNA合成

C．在DNA親和載體中提供一個反應(yīng)基

D．合成一種密度較高的DNA以便用離心分離法予以鑒別

E．在DNA中造成一個能被溫和化學方法裂解的特異部位

18．關(guān)于DNA指導(dǎo)的RNA合成，下列敘述哪一項是錯誤的：

A．只有在DNA存在時，RNA聚合酶才能催化磷酸二酯鍵的生成

B．轉(zhuǎn)錄過程中，RNA聚合酶需要引物

C．RNA鏈的合成是從5′→3′端

D．大多數(shù)情況下只有一股DNA鏈作為模板

E．合成的RNA鏈從來沒有環(huán)狀的

19．下列關(guān)于σ因子的敘述哪一項是正確的：

A．是RNA聚合酶的亞基，起辨認轉(zhuǎn)錄起始點的作用

B．是DNA聚合酶的亞基，容許按5′→3′和3′→5′雙向合成

C．是50S核蛋白體亞基，催化肽鏈生成

D．是30S核蛋白體亞基，促進mRNA與之結(jié)合

E．在30S亞基和50S亞基之間起搭橋作用，構(gòu)成70S核蛋白體

20．真核生物RNA聚合酶I催化轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是：

A．mRNA ?????????B．45S-rRNA

C．5S-rRNA ???????D．tRNA ????????E．SnRNA

21．下列關(guān)于真核細胞DNA復(fù)制的敘述哪一項是錯誤的：

A．是半保留式復(fù)制???????B．有多個復(fù)制叉

C．有幾種不同的DNA聚合酶???????D．復(fù)制前組蛋白從雙鏈DNA脫出

E．真核DNA聚合酶不表現(xiàn)核酸酶活性

22．下列關(guān)于原核細胞轉(zhuǎn)錄終止的敘述哪一項是正確的：

A．是隨機進行的??????????????B．需要全酶的ρ亞基參加

C．如果基因的末端含G—C豐富的回文結(jié)構(gòu)則不需要ρ亞基參加

D．如果基因的末端含A—T豐富的片段則對轉(zhuǎn)錄終止最為有效

E．需要ρ因子以外的ATP酶

23．下列關(guān)于大腸桿菌DNA連接酶的敘述哪些是正確的：

A．催化DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)之斷開的DNA鏈間形成磷酸二酯鍵

B．催化兩條游離的單鏈DNA分子間形成磷酸二酯鍵

C．產(chǎn)物中不含AMP

D．需要ATP作能源

24．下列關(guān)于真核細胞mRNA的敘述不正確的是：

A．它是從細胞核的RNA前體—核不均RNA生成的

B．在其鏈的3′端有7-甲基鳥苷，在其5′端連有多聚腺苷酸的PolyA尾巴

C．它是從前RNA通過剪接酶切除內(nèi)含子連接外顯子而形成的

D．是單順反子的

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（四）是非判斷題

（?）1．中心法則概括了DNA在信息代謝中的主導(dǎo)作用。

（?）2．原核細胞DNA復(fù)制是在特定部位起始的，真核細胞則在多個位點同時起始進行復(fù)制。

（?）3．逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA指導(dǎo)的DNA合成不需要RNA引物。

（?）4．原核細胞和真核細胞中許多mRNA都是多順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

（?）5．因為DNA兩條鏈是反向平行的，在雙向復(fù)制中一條鏈按5′→3′的方向合成，另一條鏈按3′→5′的方向合成。

（?）6．限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段都具有粘性末端。

（?）7．已發(fā)現(xiàn)一些RNA前體分子具有催化活性，可以準確地自我剪接，被稱為核糖酶（ribozyme），或稱核酶。

（?）8．重組修復(fù)可把DNA損傷部位徹底修復(fù)。

（?）9．原核生物中mRNA一般不需要轉(zhuǎn)錄后加工。

（?）10．RNA聚合酶對弱終止子的識別需要專一的終止因子(如蛋白)。

（?）11．原核細胞啟動子中RNA聚合酶牢固結(jié)合并打開DNA雙鏈的部分稱為Pribnow box，真核細胞啟動子中相應(yīng)的順序稱為Hogness box，因為富含A-T，又稱TATA box。

（?）12．增強子（endancer）是真核細胞DNA上一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，它們自己并沒有啟動子活性，卻具有增強啟動子活性轉(zhuǎn)錄起始的效能。

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（五）問答題

1. 簡述中心法則。

2.?????? DNA復(fù)制的基本規(guī)律？

3.?????? 簡述DNA復(fù)制的過程？

4.?????? 簡述DNA復(fù)制時酶系。

5. 簡述原核細胞和真核細胞的RNA聚合酶有何不同？

6. 簡述RNA轉(zhuǎn)錄的過程？

7. 簡述基因工程過程。

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三、參?考?答?案

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（一）名詞解釋

1．半保留復(fù)制：雙鏈DNA的復(fù)制方式，其中親代鏈分離，每一子代DNA分子由一條親代鏈和一條新合成的鏈組成。

2．不對稱轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄通常只在DNA的任一條鏈上進行，這稱為不對稱轉(zhuǎn)錄。

3．逆轉(zhuǎn)錄：Temin和Baltimore各自發(fā)現(xiàn)在RNA腫瘤病毒中含有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，才證明發(fā)生逆向轉(zhuǎn)錄，即以RNA為模板合成DNA。

4．岡崎片段：一組短的DNA片段，是在DNA復(fù)制的起始階段產(chǎn)生的，隨后又被連接酶連接形成較長的片段。在大腸桿菌生長期間，將細胞短時間地暴露在氚標記的胸腺嘧啶中，就可證明岡崎片段的存在。岡崎片段的發(fā)現(xiàn)為DNA復(fù)制的科恩伯格機理提供了依據(jù)。

5．復(fù)制叉：復(fù)制?DNA分子的?Y形區(qū)域。在此區(qū)域發(fā)生鏈的分離及新鏈的合成。

6．領(lǐng)頭鏈：DNA的雙股鏈是反向平行的，一條鏈是5/→3/方向，另一條是3/→5/方向，上述的起點處合成的領(lǐng)頭鏈，沿著親代DNA 單鏈的3/→5/方向（亦即新合成的DNA沿5/→3/方向）不斷延長。所以領(lǐng)頭鏈是連續(xù)的。

7．隨后鏈：已知的DNA聚合酶不能催化DNA鏈朝3/→5/方向延長，在兩條親代鏈起點的3/ 端一側(cè)的DNA鏈復(fù)制是不連續(xù)的，而分為多個片段，每段是朝5/→3/方向進行，所以隨后鏈是不連續(xù)的。

8．有意義鏈：即華森鏈，華森——克里格型DNA中，在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄的那股DNA鏈。簡寫為W strand。

9．光復(fù)活：將受紫外線照射而引起損傷的細菌用可見光照射，大部分損傷細胞可以恢復(fù)，這種可見光引起的修復(fù)過程就是光復(fù)活作用。

10．重組修復(fù)：這個過程是先進行復(fù)制，再進行修復(fù)，復(fù)制時，子代DNA鏈損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口，這可通過分子重組從完整的母鏈上，將一段相應(yīng)的多核苷酸片段移至子鏈的缺口處，然后再合成一段多核昔酸鍵來填補母鏈的缺口，這個過程稱為重組修復(fù)。

11．內(nèi)含子：真核生物的mRNA前體中，除了貯存遺傳序列外，還存在非編碼序列，稱為內(nèi)含子。

12．外顯子：真核生物的mRNA前體中，編碼序列稱為外顯子。

13．基因載體：外源DNA片段（目的基因）要進入受體細胞，必須有一個適當?shù)倪\載工具將帶入細胞內(nèi)，并載著外源DNA一起進行復(fù)制與表達，這種運載工具稱為載體。

14．質(zhì)粒：是一種在細菌染色體以外的遺傳單元，一般由環(huán)形雙鏈DNA構(gòu)成，其大小從1—200Kb。

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（二）、填空題答案

1．領(lǐng)頭鏈；連續(xù)的；隨從鏈；不連續(xù)的；5′；RNA；5′?→3′。

2．NAD+；ATP。

3．；；

4．有意義鏈。

5．反向轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄酶。

6．不作用；不作用；不作用；Up+Gp+Cp+A；UpGp+CpA；GpCp+Up+A；

7．轉(zhuǎn)換；顛換；插入；缺失。

8．氨基；酮基；轉(zhuǎn)換。

9．5′→3′?

10．連續(xù)?相同??不連續(xù)??相反

11．利福平??dNTP

12．5′→3′聚合??3′→5′外切??5′→3外切??焦磷酸解作用，焦磷酸交換作用

13．拓樸異構(gòu)酶??使超螺旋DNA變?yōu)樗神Y狀

14．復(fù)制位點??多位點??

15．3′→5′核酸外切酶??校對

16．3 ?DNA聚合酶Ⅲ??DNA聚合酶Ⅱ

17．專一的核酸內(nèi)切酶???解鏈酶???DNA聚合酶Ⅰ??DNA連接酶??

18．SSB（單鏈結(jié)合蛋白）

19．RNA引物??DNA聚合酶Ⅲ??DNA聚合酶Ⅰ??DNA連接酶

20．同一RNA聚合酶??3 ?RNA聚合酶Ⅰ??RNA聚合酶Ⅱ??RNA聚合酶Ⅲ

21．啟動子??編碼??終止子

22．隔裂基因??外顯子??內(nèi)含子??外顯子??內(nèi)含子

23．組??非組????非組

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（三）選擇題

1．（A）DNA半保留復(fù)制需要來自親代的每一條標記鏈作模板合成互補鏈，以保持與親代相同的完整結(jié)構(gòu)。因此，在無記溶液中進行第一輪復(fù)制將產(chǎn)生兩個半標記分子。第二輪復(fù)制將產(chǎn)生兩個半標記分子和兩個不帶標記的雙鏈DNA分子。

2．（E）在DNA真正能夠開始復(fù)制之前，必須由解鏈酶使DNA雙鏈結(jié)構(gòu)局部解鏈。在每股單鏈DNA模板上，由RNA聚合酶（引物酶）催化合成一小段（大約10—50個核苷酸）互補RNA引物。然后由DNA聚合酶Ⅲ向引物3′端加入脫氧核苷—5′—三磷酸，從5′→3′方向合成DNA片段（岡崎片段），直至另一RNA引物的5′末端。接著在DNA聚合酶Ⅰ的作用下將RNA引物從5′端逐步降解除去與之相鄰的DNA片段由3′端延長，以填補RNA除去后留下的空隙。最后由DNA連接酶將DNA片段連接成完整連續(xù)的DNA鏈。

3．（D）DNA復(fù)制三代后，每八個完整DNA雙鏈中將有兩個雙鏈分子含有一股親代鏈。

4．（E）DNA是由DNA聚合酶Ⅲ復(fù)合體復(fù)制的。該酶催化脫氧三磷酸核苷以核苷酸的形式加到RNA引物鏈上，選擇只能與親鏈DNA堿基互補配對的核苷酸參入。參入的第一個脫氧核苷酸以共價的磷酸二酯鍵與引物核苷酸相連。鏈的生長總是從5′向3′延伸的。DNA復(fù)制開始于特異起始點，定點雙向進行。

5．（A）DNA復(fù)制必需胸腺嘧啶（T）與腺嘌呤（A）配對，鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）配對，從而使雙螺旋兩鏈之間部分地靠氨基與酮基間形成的氫鍵維系起來。鏈本身是反向平行方向合成的，即題中所述之磷酸二酯鍵的5′→3′順序決定其沿3′→5′方向互補。

6．（B）DNA聚合酶Ⅰ在起聚合酶作用時必需要有模板和引物。這個一條肽鏈的蛋白質(zhì)除聚合酶活性外還具有3′和5′外切核酸酶活性。在正常DNA復(fù)制時，它的作用是水解RNA引物鏈（5′→3′外切核酸酶活性）并用模板指導(dǎo)的脫氧核苷酸取代它們（聚合功能）。DNA聚合酶Ⅰ也參與DNA修復(fù)。例如在切除胸腺嘧啶二聚體中起5′→3′外切核酸酶的作用。在正常DNA復(fù)制時，DNA聚合酶Ⅰ表現(xiàn)3′外切核酸酶活性，切除錯誤參入的脫氧核苷酸殘基。岡崎片段是由DNA聚合酶Ⅲ復(fù)合體產(chǎn)生的，而不是DNA聚合酶Ⅰ。在除去RNA引物鏈后，DNA片段通過DNA連接酶連接。DNA聚合酶Ⅱ，其功能目前還不清楚，一些細菌突變體，雖無DNA聚合酶Ⅱ，但卻能正常生長。DNA聚合酶Ⅰ則是正常生長所必需的。

7．（B）真核生物中有三種DNA聚合酶，αβ及γ。DNApolα在細胞核DNA復(fù)制中起作用；DNApolβ在細胞核DNA修復(fù)中起作用；而DNApolγ則在線粒體DNA復(fù)制中起作用。它們都需要引物，都用脫氧三磷酸核苷作底物，都按5′→3′方向合成新生DNA鏈。真核生物DNA聚合酶任何一種均不表現(xiàn)核酸酶活性。

8．（B）DNA復(fù)制時，如果兩股鏈按5′→3′方向先合成短的DNA片段，然后再連接成連續(xù)的鏈，這就能使DNA的兩條反向互補鏈能夠同時按5′→3′方向的聚合機制進行復(fù)制。岡崎首先從大腸桿菌中分離出正在復(fù)制的新生DNA，并發(fā)現(xiàn)這新生DNA是由一些不連續(xù)片段（岡崎片段）所組成。在大腸桿菌生長期間，將細胞短時間地暴露在氚標記的胸腺嘧啶中，在將細胞DNA變性處理（也就是解鏈）之后，岡崎分離得到了標記的DNA片段。它們是單鏈的，并且由于DNA聚合酶Ⅲ復(fù)合體用RNA作引物，因此新生岡崎片段以共價鍵連著小段RNA鏈，但它們既不是堿基互補的RNA—DNA雙鏈雜合體，也不是來自親鏈的片段。新生岡崎片段決不會被核酸酶切除。

9．（D）DNA鏈內(nèi)胸腺嘧啶二聚體可因紫外線（UV）照射而形成。專一的修復(fù)系統(tǒng)依賴UV—特異的內(nèi)切核酸酶，它能識別胸腺嘧啶二聚體，并且通常在二聚體5′側(cè)切斷磷酸二酯鍵從而在DNA鏈內(nèi)造成一個缺口。損傷序列的切除以及用完整的互補鏈作為模板重新合成切去的片段都是由DNA聚合酶Ⅰ來完成的。主鏈與新合成片段之間的裂口則由DNA連接酶接合。堿基缺失、插入、甲基化，或烷基化均不能作為切除修復(fù)體系靶子而為UV—特異性內(nèi)切核酸酶所識別。

10．（C）DNA連接酶能夠連接留有缺口的DNA鏈或閉合單股DNA鏈以形成環(huán)狀?DNA分子。該酶需要一股鏈末端的游離3/-OH和另一股鏈末端的5/-磷酸，并且要求這兩股鏈是雙鏈DNA的一部分。反應(yīng)是吸能的，因此需要能源。在大腸桿菌和其它細菌中，能源是NAD+分子中的焦磷酸鍵。NAD+先與酶形成酶—AMP復(fù)合物，同時釋放叮NAD的尼克酰胺單核苷酸；酶一AMP復(fù)合物上的AMP再轉(zhuǎn)移到DNA鏈的5/-磷酸基上，使其活化，然后形成磷酸二酯鍵并釋放AMP。

11．（E）RNA聚合酶和DNA聚合酶都是以三磷酸核苷（NTP或dNTP）為其底物，這兩種聚合酶都是在生長中的多核苷酸鏈的3′端加接核苷酸單位。DNA聚合酶合成與DNA互補的DNA。合成與RNA互補的DNA的酶稱作逆轉(zhuǎn)錄酶。

12．（B）紫外線（260nm）照射可引起DNA分子中同一條鏈相鄰胸腺嘧啶之間形成二聚體，并從該點終止復(fù)制。該二聚體可由包括連接酶在內(nèi)的酶系切除和修復(fù)，或在光復(fù)合過程中，用較長（330—450nm）或較短（230nm）波長的光照射將其分解。

13．（E）DNA鏈中插入一個額外核苷酸會引起移碼突變并使突變點以后轉(zhuǎn)錄的全部mRNA發(fā)生翻譯錯誤。題中列出的所有其它突變通常僅引起一個氨基酸的錯誤（如題中的A或B），或從氨基酸序列中刪除一個氨基酸（D），或在氨基酸順序中完全沒有錯誤。需要指出的是，如果A或B突變導(dǎo)致生成“無意義”或鏈終止密碼子，則這種突變所造成的后果也會象移碼突變那樣是致死的。

14．（E）在Hbs中，β鏈上一個纈氨酸殘基替換了谷氨酸，這是由于一個核苷酸堿基的點突變所造成的后果。即位于三聯(lián)體第二位的胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換為腺嘌呤。

15．（A）自發(fā)點突變多半是由于嘌呤或嘧啶堿中氫原子的互變異構(gòu)移位而引起的。在DNA復(fù)制中，這種移位會引起堿基配對的改變。某些誘變劑如5—溴尿嘧啶和2—氨基嘌呤可促進DNA堿基的互變異構(gòu)。

16．（A）吖啶衍生物可導(dǎo)致一個堿基對的插入或缺失，從而引起移碼突變。5—溴尿嘧啶可引起轉(zhuǎn)換突變，因為溴取代了胸腺嘧啶的甲基，這樣則增加了烯醇式互變異構(gòu)物與鳥嘌呤而不是腺嘌呤進行堿基配對的可能性。咪唑硫嘌呤可轉(zhuǎn)變?yōu)?—巰基嘌呤，后者是嘌呤的類似物。乙基乙磺酸可通過使鳥嘌呤烷基化引起轉(zhuǎn)換突變。

17．（D）5—溴尿嘧啶可代替胸腺嘧啶參入到DNA中，從而產(chǎn)生密度較高的DNA。然后可在氯化銫密度梯度中用離心法對新合成的DNA進行定量分析。DNA中的5—溴尿嘧啶較正常胸嘧啶既不更活潑又不更易被斷裂，也不能象吖啶染料那樣引起移碼突變。

18．（B）RNA聚合酶必須以DNA為模板催化合成RNA，通常只轉(zhuǎn)錄雙螺旋DNA其中的一條鏈。RNA鏈的合成方向是從5′到3′端，產(chǎn)物從來沒有環(huán)狀分子。與DNA聚合酶不同，RNA聚合酶不需要引物。

19．（A）σ因子是RNA聚合酶的一個亞基，σ因子本身沒有催化功能，它的作用是與核心酶結(jié)合，對轉(zhuǎn)錄的起始特異性起決定性的作用。在有σ因子的情況下，RNA聚合酶將選擇DNA準備轉(zhuǎn)錄的那條鏈，并在適當?shù)膯踊虿课婚_始轉(zhuǎn)錄。

20．（B）真核生物有三種RNA聚合酶，它們分別催化45S—rRNA（RAN聚合酶Ⅰ）mRNA和SnRNA（RNA聚合酶Ⅱ），以及tRNA和5S—rRNA（RNA聚合酶Ⅲ）的合成。這三種酶可以根據(jù)它們對抗生素α—鵝膏蕈堿的敏感度不同加以區(qū)別：RNA聚合酶Ⅰ耐受；RNA聚合酶Ⅱ極敏感；RNA聚合酶Ⅲ中等敏感。RNA聚合酶Ⅰ催化合成的45S原始轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工而成為成熟的18S—rRNA，5.8S—rRNA和28S—rRNA。

21．（D）真核生物DNA在多個復(fù)制叉上按半保留方式復(fù)制。真核生物有三種DNA聚合酶：α、β及γ。分別參加細胞核DNA復(fù)制，細胞核DNA修復(fù)，以及線粒體DNA復(fù)制。真核生物DNA聚合酶一般都不具有核酸酶活性。真核DNA復(fù)制時，組蛋白不從DNA解離下來，而是留在含有領(lǐng)頭子鏈的雙鏈DNA上。新合成的組蛋白則與隨從子鏈結(jié)合。

22．（C）原核細胞轉(zhuǎn)錄終止不是隨機進行的，據(jù)目前所知有兩種轉(zhuǎn)錄終止方式即依賴Rho (ρ)因子與不依賴Rho因子的方式。不依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，即在基因的末端含G—C豐富的回文結(jié)構(gòu)，當RNA轉(zhuǎn)錄延長至該部位時，按模板轉(zhuǎn)錄出的RNA堿基序列會立即形成發(fā)夾型的二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)是阻止轉(zhuǎn)錄繼續(xù)向下游推進的關(guān)鍵。Rho因子是RNA聚合酶之外的一種蛋白質(zhì)，有控制轉(zhuǎn)錄終止的作用。Rho因子本身似乎就具有ATP酶的活性。

23．B：DNA連接酶催化DNA鏈兩段之間形成磷酸二酯鍵，但這兩段必須是在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)之中，它不能將兩條游離的單鏈DNA分子連接起來。在大腸桿菌中，成鍵所需能量來自NAD，產(chǎn)物是AMP和煙酰胺單核苷酸；而在某些動物細胞以及噬菌體中，則以ATP作為能源。DNA連接酶在DNA合成、修復(fù)以及重組中都是十分重要的。

24．B：真核mRNA是從2至20千堿基長的細胞核RNA前體——核不均—RNA（hnRNA）形成的。所有真核mRNA5′端均具有5′—5′焦磷酸連接的7-甲基鳥苷（帽結(jié)構(gòu)）。大多數(shù)真核mRNA的3′端連有150至200個核苷酸長度的聚腺苷酸尾鏈。從mRNA前體切除內(nèi)含子是由具有高度專一性的酶性催化完成的。內(nèi)含子是不被翻譯的。真核生物mRNA是單順反子的。

?

（四）是非題

1．對?????2．對?????3．錯?????4．錯?????5．錯?????6．錯

7．對?????8．錯?????9．對????10．對????11．對????12．對

（五）問答題

1．答：在細胞分裂過程中通過DNA的復(fù)制把遺傳信息由親代傳遞給子代，在子代的個體發(fā)育過程中遺傳信息由DNA傳遞到RNA，最后翻譯成特異的蛋白質(zhì)；在RNA病毒中RNA具有自我復(fù)制的能力，并同時作為mRNA，指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的生物合成；在致癌RNA病毒中，RNA還以逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。

2.答：（1）復(fù)制過程是半保留的。

（2）細菌或病毒DNA的復(fù)制通常是由特定的復(fù)制起始位點開始，真核細胞染色體DNA復(fù)制則可以在多個不同部位起始。

（3）復(fù)制可以是單向的或是雙向的，以雙向復(fù)制較為常見，兩個方向復(fù)制的速度不一定相同。

（4）兩條DNA鏈合成的方向均是從5’向3’方向進行的。

（5）復(fù)制的大部分都是半不連續(xù)的，即其中一條領(lǐng)頭鏈是相對連續(xù)的，其他隨后鏈則是不連續(xù)的。

（6）各短片段在開始復(fù)制時，先形成短片段RNA作為DNA合成的引物，這一RNA片段以后被切除，并用DNA填補余下的空隙。

3.答：DNA復(fù)制從特定位點開始，可以單向或雙向進行，但是以雙向復(fù)制為主。由于?DNA雙鏈的合成延伸均為5′→3′的方向，因此復(fù)制是以半不連續(xù)的方式進行，可以概括為：雙鏈的解開；RNA引物的合成；DNA鏈的延長；切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段。

（1）雙鏈的解開??在DNA的復(fù)制原點，雙股螺旋解開，成單鏈狀態(tài)，形成復(fù)制叉，分別作為模板，各自合成其互補鏈。在復(fù)制叉上結(jié)合著各種各樣與復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子。

（2）RNA引物的合成??引發(fā)體在復(fù)制叉上移動，識別合成的起始點，引發(fā)RNA引物的合成。移動和引發(fā)均需要由ATP提供能量。以DNA為模板按5′→3′的方向，合成一段引物RNA鏈。引物長度約為幾個至10個核苷酸。在引物的5′端含3個磷酸殘基，3′端為游離的羥基。

（3）DNA鏈的延長??當RNA引物合成之后，在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，以四種脫氧核糖核苷5′-三磷酸為底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出PPi。DNA鏈的合成是以兩條親代DNA鏈為模板，按堿基配對原則進行復(fù)制的。親代DNA的雙股鏈呈反向平行，一條鏈是5′→3′方向，另一條鏈是3′→5′方向。在一個復(fù)制叉內(nèi)兩條鏈的復(fù)制方向不同，所以新合成的二條子鏈極性也正好相反。由于迄今為止還沒有發(fā)現(xiàn)一種DNA聚合酶能按3′→5′方向延伸，因此子鏈中有一條鏈沿著親代DNA單鏈的3′→5′方向（亦即新合成的DNA沿5′→3′方向）不斷延長。

（4）切除引物，填補缺口，連接修復(fù)??當新形成的岡崎片段延長至一定長度，其3′-OH端與前面一條老片斷的5′斷接近時，在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，在引物RNA與DNA片段的連接處切去RNA引物后留下的空隙，由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補上；在DNA連接酶的作用下，連接相鄰的DNA鏈；修復(fù)摻入DNA鏈的錯配堿基。這樣以兩條親代DNA鏈為模板，就形成了兩個DNA雙股螺旋分子。每個分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。

4.答：（1）原核細胞大腸桿菌的RNA聚合酶研究的較深入。這個酶的全酶由5種亞基（α2ββ′δω）組成，還含有2個Zn原子。在RNA合成起始之后，δ因子便與全酶分離。不含δ因子的酶仍有催化活性，稱為核心酶。δ亞基具有與啟動子結(jié)合的功能，β亞基催化效率很低，而且可以利用別的DNA的任何部位作模板合成RNA。加入δ因子后，則具有了選擇起始部位的作用，δ因子可能與核心酶結(jié)合，改變其構(gòu)象，從而使它能特異地識別DNA模板鏈上的起始信號。

（2）真核細胞的細胞核內(nèi)有RNA聚合酶I、II和III，通常由4～6種亞基組成，并含有Zn2+。RNA聚合酶I存在于核仁中，主要催化rRNA前體的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ存在于核質(zhì)中，分別催化mRNA前體和小分子量RNA的轉(zhuǎn)錄。此外線粒體和葉綠體也含有RNA聚合酶，其特性類似原核細胞的RNA聚合酶。

5.答：RNA轉(zhuǎn)錄過程為起始位點的識別、起始、延伸、終止。

（1）起始位點的識別??RNA聚合酶先與DNA模板上的特殊啟動子部位結(jié)合，σ因子起著識別DNA分子上的起始信號的作用。在σ亞基作用下幫助全酶迅速找到啟動子，并與之結(jié)合生成較松弛的封閉型啟動子復(fù)合物。這時酶與DNA外部結(jié)合，識別部位大約在啟動子的-35位點處。接著是DNA構(gòu)象改變活化，得到開放型的啟動子復(fù)合物，此時酶與啟動子緊密結(jié)合，在-10位點處解開DNA雙鏈，識別其中的模板鏈。由于該部位富含A-T堿基對，故有利于DNA解鏈。開放型復(fù)合物一旦形成，DNA就繼續(xù)解鏈，酶移動到起始位點。

（2）起始留在起始位點的全酶結(jié)合第一個核苷三磷酸。第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP。形成的啟動子、全酶和核苷三磷酸復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物，第一個核苷酸摻入的位置稱為轉(zhuǎn)錄起始點。這時σ亞基被釋放脫離核心酶。

（3）延伸??從起始到延伸的轉(zhuǎn)變過程，包括σ因子由締合向解離的轉(zhuǎn)變。DNA分子和酶分子發(fā)生構(gòu)象的變化，核心酶與DNA的結(jié)合松弛，核心酶可沿模板移動，并按模板序列選擇下一個核苷酸，將核苷三磷酸加到生長的RNA鏈的3′-OH端，催化形成磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄延伸方向是沿DNA模板鏈的3′→5′方向按堿基酸對原則生成5′→3′的RNA產(chǎn)物。RNA鏈延伸時，RNA聚合酶繼續(xù)解開一段DNA雙鏈，長度約17個堿基對，使模板鏈暴露出來。新合成的RNA鏈與模板形成RNA-DNA的雜交區(qū)，當新生的RNA鏈離開模板DNA后，兩條DNA鏈則重新形成雙股螺旋結(jié)構(gòu)。

（4）?終止??在DNA分子上有終止轉(zhuǎn)錄的特殊堿基順序稱為終止子，它具有使RNA聚合酶停止合成RNA和釋放RNA鏈的作用。這些終止信號有的能被RNA聚合酶自身識別，而有的則需要有ρ因子的幫助。ρ因子是一個四聚體蛋白質(zhì)，它能與RNA聚合酶結(jié)合但不是酶的組分。它的作用是阻RNA聚合酶向前移動，于是轉(zhuǎn)錄終止，并釋放出已轉(zhuǎn)錄完成的RNA鏈。對于不依賴于ρ因子的終止子序列的分析，發(fā)現(xiàn)有兩個明顯的特征：即在DNA上有一個15～20個核苷酸的二重對稱區(qū)，位于RNA鏈結(jié)束之前，形成富含G-C的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。接著有一串大約6個A的堿基序列它們轉(zhuǎn)錄的RNA鏈的末端為一連串的U。寡聚U可能提供信號使RNA聚合酶脫離模板。在真核細胞內(nèi)，RNA的合成要比原核細胞中的復(fù)雜得多。

6.?答：（1）目的基因調(diào)取 ?體外操作DNA的主要步驟之一是提取載體DNA和所需要的外源目的基因。在細胞中DNA并非以游離態(tài)分子存在，而是和RNA及蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成復(fù)合體。DNA純化的基本步驟是:（1）從破壞的細胞壁和膜里釋放出可溶性的DNA；（2）通過變性或蛋白質(zhì)分解，使DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合體解離；（3）將DNA從其它大分子中分離出來；（4）DNA濃度和純度的光學測定。

（2）載體選擇 ?外源DNA片段（目的基因）要進入受體細胞，必須有一個適當?shù)倪\載工具將帶入細胞內(nèi)，并載著外源DNA一起進行復(fù)制與表達，這種運載工具稱為載體。載體必須具備下列條件：①在受體細胞中，載體可以獨立地進行復(fù)制。所以載體本身必須是一個復(fù)制單位，稱復(fù)制子，具有復(fù)制起點。而且插入外源DNA后不會影響載體本身復(fù)制的能力。②易于鑒定、篩選。也就是說，容易將帶有外源DNA的重組體與不帶外源DNA的載體區(qū)別開來。③易于引入受體細胞。

（3）連接 ?外源DNA與載體DNA之間可以通過多種方式相連接，主要有以下幾種：①粘性末端連接；②平頭末端連接；③接頭連接等。

（4）轉(zhuǎn)化 ?任何外源DNA重組到載體上，然后轉(zhuǎn)入受體細胞中復(fù)制繁殖，這一過程稱為DNA的克隆。外源DNA進入受體細胞并使它獲得新遺傳特性的過程稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化作用是將外源DNA引入細胞的過程。

（5）篩選 ?由于細胞轉(zhuǎn)化的頻率較低，所以從大量的宿主細胞中篩選出帶有重組體的細胞并不是很容易的，當前，在實驗室中，常用的篩選手段有以下幾種：①?插入失活；②?菌落原位雜交；③?免疫學方法．此外，對重組體轉(zhuǎn)化的鑒定還可以采用表現(xiàn)型的鑒定；對重組質(zhì)粒純化并重新轉(zhuǎn)化；限制性酶切圖譜的繪制；重組質(zhì)粒上的基因定位等更深入的方法。