? ? ? 生長(zhǎng)素（IAA，分子量175）作為第一種被發(fā)現(xiàn)的植物激素，生長(zhǎng)素幾乎參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的每一個(gè)過(guò)程。1928年，Went Fritz Warmolt用實(shí)驗(yàn)證明胚芽鞘尖端有一種可以促進(jìn)生長(zhǎng)的物質(zhì)，將其稱之為生長(zhǎng)素。進(jìn)一步研究確定生長(zhǎng)素的化學(xué)本質(zhì)是吲哚乙酸（IAA, Indole-3-acetic acid）?，F(xiàn)代生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PIN-FORMED (PIN)蛋白家族參與調(diào)控生長(zhǎng)素從植物細(xì)胞胞質(zhì)側(cè)運(yùn)輸?shù)桨鈪^(qū)，因此，PIN也被稱為生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3。區(qū)別于其它植物激素，生長(zhǎng)素在細(xì)胞與細(xì)胞之間的運(yùn)輸過(guò)程具有方向性，這一過(guò)程也被稱為極性運(yùn)輸而PIN家族蛋白就在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。特定PIN家族成員在細(xì)胞質(zhì)膜上具有不對(duì)稱分布的特點(diǎn)，它們的分布位置決定了生長(zhǎng)素“搬運(yùn)”的方向。解析PIN蛋白的三維結(jié)構(gòu)是生長(zhǎng)素研究領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。NPA是之前在實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的一種生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑，生化證據(jù)表明，NPA可以直接靶向PIN蛋白，但是究竟是如何發(fā)揮作用的一直不清楚。

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? ? ? 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)與浙江大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在這兩篇研究論文中（圖1），同時(shí)報(bào)道了植物中生長(zhǎng)素極性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN以及PIN與生長(zhǎng)素IAA結(jié)合、PIN與除草劑NPA結(jié)合的三個(gè)高分辨率結(jié)構(gòu)，并結(jié)合SPR及ITC分子互作技術(shù)闡明了膜蛋白PIN與生長(zhǎng)素IAA（分子量175 Da）和除草劑NPA的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，為剖析植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸調(diào)控以及針對(duì)PIN蛋白的農(nóng)業(yè)用除草劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

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? ? ? 浙江大學(xué)研研究人員通過(guò)體外放射性3H-IAA轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了AtPIN3的關(guān)鍵氨基酸殘基在IAA轉(zhuǎn)運(yùn)和NPA抑制過(guò)程中的重要作用，通過(guò)表面等離子體共振技術(shù)（SPR）驗(yàn)證了關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)IAA和NPA結(jié)合AtPIN3的親和力的影響。3H-IAA外排實(shí)驗(yàn)和表面等離子體共振技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了冷凍電鏡結(jié)構(gòu)中觀察到的IAA和NPA與AtPIN3的結(jié)合模式。進(jìn)一步，科研人員系統(tǒng)性地解析了AtPIN3在apo狀態(tài)、底物（IAA）結(jié)合狀態(tài)以及抑制劑（NPA）結(jié)合狀態(tài)下的高分率結(jié)構(gòu)，揭示了AtPIN3的結(jié)構(gòu)、IAA識(shí)別機(jī)制以及NPA抑制的分子機(jī)制，將有力促進(jìn)對(duì)PIN介導(dǎo)的生長(zhǎng)素運(yùn)輸分子機(jī)制的理解，為靶向該轉(zhuǎn)運(yùn)體的創(chuàng)新農(nóng)藥研發(fā)打下基礎(chǔ)。

? ? ? 為驗(yàn)證IAA在蛋白PIN3上的結(jié)合位點(diǎn)與關(guān)鍵氨基酸，科研人員通過(guò)SPR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膜蛋白PIN3與IAA直接結(jié)合，親和力KD為160.4?μM（圖3）；對(duì)PIN3蛋白上關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變（V51A, N112A, L114A, V137A, Q140A, Y145A, I600A和V601A）后，其與IAA的親和力顯著降低，其中Y145A突變后親和力降低最多，為402.2 μM（圖4），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些氨基酸位點(diǎn)對(duì)于IAA與PIN3的結(jié)合均很重要，從而確定了IAA在PIN3上結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，與結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)高度一致。

? ? ? 為進(jìn)一步驗(yàn)證除草劑NPA的結(jié)合位點(diǎn)是否與IAA結(jié)合位點(diǎn)相同，以及NPA抑制IAA的分子機(jī)制，科研人員通過(guò)Biacore實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膜蛋白PIN3與NPA直接結(jié)合，親和力KD為56.2?μM，強(qiáng)于IAA與PIN3的親和力（160.4?μM）（圖2）；對(duì)PIN3蛋白上IAA結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)突變（V51A, N112A, L114A, V137A, Q140A, Y145A, I600A和V601A）后，結(jié)果同樣顯示，突變后與NPA的親和力顯著降低（圖4），表明 NPA與PIN3的結(jié)合位點(diǎn)與IAA相同。因此，NPA通過(guò)直接結(jié)合PIN3蛋白上的IAA結(jié)合位點(diǎn)，以較高的親和力抑制PIN3的IAA轉(zhuǎn)運(yùn)活性。最終，闡明了PIN3與生長(zhǎng)素IAA和除草劑NPA的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

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? ? ? 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)研究人員利用體外納米抗體合成技術(shù)，篩選得到了靶向PIN1蛋白的納米抗體，并利用冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)，成功解析了PIN1、PIN1-IAA 和PIN1-NPA的結(jié)構(gòu)(圖5），分辨率為3.0埃的結(jié)構(gòu)，首次揭示了經(jīng)典PIN家族蛋白成員的三維結(jié)構(gòu)。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步解析了PIN1與生長(zhǎng)素IAA、抑制劑NPA結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，揭示了PIN1蛋白“裝載”生長(zhǎng)素，以及NPA“鳩占鵲巢”阻制生長(zhǎng)素“搬運(yùn)”的全貌。?

? ? ? ?利用ITC及SPR分子互作技術(shù)檢測(cè)證實(shí)， PIN1也能與生長(zhǎng)素IAA直接結(jié)合，SPR技術(shù)測(cè)得親和力KD為186?μM（圖6）ITC技術(shù)測(cè)得的親和力為83μM(圖7），與PIN3與IAA的親和力（KD為160.4?μM，圖3）相當(dāng)；同時(shí)，他們還檢測(cè)了PIN1與其他天然生長(zhǎng)素（IBA、IPA、4-Cl-IAA）均能結(jié)合（圖6）。利用ITC技術(shù)檢測(cè)了IAA及NPA與野生型PIN1及突變型PIN1的親和力（圖7、圖8）。

Surface plasmon resonance?實(shí)驗(yàn)方法：

SPR experiments for IAA, indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA) and 4-chloroindole-3-acetic acid (4-Cl-IAA) were carried out on a Biacore 8K system (Cytiva) at 25?°C with a flow rate of 30?μl min?1. Purified wild-type PIN1 protein were immobilized onto the series S CM5 sensor chips (Cytiva) by amine-coupling chemistry. Ligands at different concentrations were flowed over the chip surface in the pH 7.0 buffer (25?mM HEPES, pH 7.0, 150?mM NaCl, 0.01% GDN, 2% DMSO) or pH 5.5 buffer (25?mM MES, pH 5.5, 150?mM NaCl, 0.01% GDN, 2% DMSO). Data were analysed with the Biacore Insight Evaluation Software Version 3.0.12 using steady state affinity binding model

利用ITC技術(shù)檢測(cè)了IAA及NPA與野生型PIN1及突變型PIN1的親和力。

IAA-ITC results for the WT PIN1 at pH 5.5.?c–f, IAA-ITC results for the PIN1 V51A, N112A, I582A and Y145A mutants at pH 7.0, respectively. No apparent binding are derived for the N112A, I582A and Y145A mutants. For V51A, the fitted binding affinity is 1.39?±?0.16?mM, 17-fold higher than that of the WT PIN1.?g,?h, NPA-ITC results for the PIN1 N112A and Y145A mutants.?i, Cartoon model for the alternating access mechanism of IAA transport by PIN1 and inhibition by NPA.

Isothermal titration calorimetry?實(shí)驗(yàn)方法：

The binding affinities between IAA and PIN1 variants were measured with a MicroCal iTC200 microcalorimeter (MicroCal). Purified wild-type or mutant PIN1 in the buffer containing 0.02% GDN, 25?mM HEPES pH 7.0 (or MES pH 5.5) and 150?mM NaCl were concentrated to about 0.05?mM for isothermal titration calorimetry titration. The protein was titrated by 5?mM IAA dissolved in an identical buffer to that used for size-exclusion chromatography at 25?°C. To measure the binding affinities between NPA and PIN1, 100?μM NPA in the buffer containing 1% DMSO, 0.02% GDN, 25?mM HEPES pH 7.0 and 150?mM NaCl was used to titrate to 0.01?mM purified protein in the identical buffer. Data were fitted using the software Origin 7.0 (MicroCal).

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參考文獻(xiàn)：

Yang, Zhisen et al. “Structural insights into auxin recognition and efflux by Arabidopsis PIN1.” Nature vol. 609,7927 (2022): 611-615.?

Su, Nannan et al. “Structures and mechanisms of the Arabidopsis auxin transporter PIN3.” Nature vol. 609,7927 (2022): 616-621.?

? ? ?佰萊博生物擁有SPR（Biacore T200/Biacore S200）、ITC、DSC、ForteBio、MALS 、分析型超離、MST（微量熱泳動(dòng)技術(shù)）、圓二色光譜技術(shù)等檢測(cè)分析平臺(tái)。提供生物大分子表征、生物分子互作分析、藥物篩選、生物大分子穩(wěn)定性分析及制劑篩選等服務(wù)。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 聯(lián)系電話：027-88316765 ，微信號(hào)：yu13377873161

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