生物素標記摩爾比的計算是基于比爾-朗伯定律（Beer–Lambert law），又稱比爾定律或比耳定律（Beer's law），是分光光度法的基本定律，即當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質時，其吸光度（absorbance，A）與吸光物質的濃度（consenreation，C）及吸收層厚度（length，L）成正比,?用公式表示為：A = ε*C* L其中A為光度，ε為摩爾吸光系數(shù),所以此處公式為A?500= ε500?C L（此處ε500=34,000M-1cm-1）

以Frdbio?HABA分析法測算生物素標記效率試劑盒（ARL0021T1）為例，

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試劑盒組分：

1.HABA溶液： ????????????1ml????10mM in 0.01M NaOH

2.超純親和素（Avidin） ????10mg

3.PBS(pH7.2)????? ?????????30ml???? 100mM 磷酸鈉，150mM NaCl

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實驗前準備：

HABA- Avidin混合液配制：5mg Avidin和300uL 10mM HABA加入到9.7ml PBS溶液中，（合格標準：1cm比色皿A500=0.9 ~ 1.3,）配置好的混合液可以在4℃保存，2周內可以正常使用，如果發(fā)現(xiàn)有沉淀或者絮狀物，請過濾或者離心后使用。

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實驗操作可以選擇分光光度法或微孔酶標板法：

分光光度法：

A． 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯，在500nm波長測量吸光值，記錄為A500(H-A);最好測量三次取平均值；

B． 在比色杯中加入100uL待測的生物素標記蛋白（Biotinylated Protein,簡稱BP），充分混勻后，在500nm波長測量吸光值，吸光值穩(wěn)定20秒以上，記錄為A500(H-A-BP);最好測量三次取平均值；如果A500(H-A-BP)<0.35,請稀釋待測樣品，再次重復此步驟。

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微孔酶標板法：

A.?????取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波長測量吸光值，記錄為A500(H-A);最好測量三次取平均值；

B.??????在微孔板中加入20uL待測的生物素標記蛋白（Biotinylated Protein,簡稱BP），震蕩或移液器吹打充分混勻后，在500nm波長測量吸光值，吸光值穩(wěn)定20秒以上，記錄為A500(H-A-BP);最好測量三次取平均值；如果A500(H-A-BP)< 0.3*A500(H-A),請稀釋待測樣品，再次重復此步驟。

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標記效率計算方法：

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標記摩爾比計算：

生物素：蛋白=[(生物素摩爾濃度*10)/蛋白原始摩爾濃度]*稀釋倍數(shù)

*本試劑僅供實驗室研究使用*

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案例演示：

以Frdbio超級生物標記試劑盒（貨號：ARL0021SK）標記Anti-Covid-19 Spike Mab?(貨號：nCoV-S-hMab-B)，標記后測算標記比，分光光度計法。

本案例中被標記蛋白為抗體，分子量（MW）為150,000,濃度為5.0mg/mL，A500(H-A)=1.090，A500(H-A-BP)=0.585，

抗體摩爾濃度計算：mM /mL=5/150000=3.33*10-5

ΔA500=（0.9*1.090）-?0.585=0.396

生物素摩爾濃度計算：mM /mL=0.396/(34000*1)=1.16*10-5

抗體：生物素（摩爾比）=(3.33*10-5)/(1.16*10-5*10)=1:3.48