核酸提取純化
核酸抽提和純化是分子生物學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)，核酸純化方法是影響提取核酸質(zhì)量高低的最重要因素，也是下游分子生物學(xué)試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。
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一、提取核酸的原因：
①為了分析基礎(chǔ)研究和疾病研究中的基因表達(dá)；
②跟蹤對藥物治療的反應(yīng)（例如，在抗病毒治療期間和之后監(jiān)測病毒滴度）。
③識別新物種并深入了解進(jìn)化過程（例如，Ancient DNA分析）。
④對人類、動物和植物中引起傳染病暴發(fā)的病原體進(jìn)行監(jiān)測和分類。
⑤通過微生物檢測和量化監(jiān)測食品和水安全。
⑥診斷疾病（如基因疾病，癌癥，免疫學(xué)缺陷）。
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二、核酸提取純化原則和要求
1、保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性
2、排除其它分子的污染（如提取DNA時排除RNA的干擾）
3、核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子
4、盡可能降低蛋白質(zhì)、多糖和脂類等大分子物質(zhì)
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三、核酸純化的方法及原理如下：
1、PC抽提法
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PC 抽提是去除蛋白質(zhì)有效的手段，但超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可去除。且每次抽提都會損失部分核酸。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以去除，以及基因組 DNA 會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點(diǎn)，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點(diǎn)要提醒的是，某些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC 抽提的，否則核酸必定降解。PC抽提最大的優(yōu)勢是成本低廉，對實(shí)驗(yàn)條件要求較低，對于經(jīng)費(fèi)緊張的實(shí)驗(yàn)室較為實(shí)用。
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2、高鹽沉淀法
高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點(diǎn)。更快、更輕松的去除蛋白質(zhì)所可以用于大規(guī)模抽提，但其不足之處是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定，蛋白質(zhì)的沉淀效率在4℃會更好一些。
3、離心柱法
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離心柱純化法，是目前試劑盒提取廣泛應(yīng)用的方法。其最大特點(diǎn)是受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。加入的液體通過離心后會進(jìn)入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子是完全分開的，所以洗滌更徹底。其致命弱點(diǎn)是樣品過量，提取效率較低，且需要反復(fù)離心，操作復(fù)雜，成本也較高。
4、生物磁珠法
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生物磁珠法是將純化介質(zhì)包被在納米級生物磁珠表面，通過介質(zhì)對核酸的吸附，在外加磁場下使核酸附著于磁珠定向移動，從而達(dá)到固液分離純化的作用。與其他幾種方法相比，生物磁珠法具有很多的優(yōu)勢，
如：①提取靈敏度高(微量材料即可提取)
?、诩兓兌雀?*與蛋白鹽等雜質(zhì)分離)
③提取產(chǎn)量高(每mg磁珠能吸附500ug DNA)
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誤區(qū)：
①磁珠使用的越多，提取效果越好——過多的磁珠將無法均勻的分散在液體中，從而喪失其分散的特性，在洗滌過程中也無法充分增加核酸磁珠和液體接觸的效率，此外過多的磁珠會吸附蛋白酶、溶菌酶等在液體體系中其主要作用的功能成分，導(dǎo)致整個試劑盒的效率低下
②試劑使用的越多，提取效果越好——每增加一部分液體體積，就會減少更多磁珠碰撞的幾率，這也意味著吸附率的大幅度下降
③洗滌次數(shù)越多，提取效果越好——每次的洗滌都會損失一定量的核酸，并且增加了核酸斷裂水解的可能性，一般控制洗滌次數(shù)在2~4次最為合適
④樣本取用的越多，提取效果越好——建議先處理經(jīng)過富集或者濃縮步驟再進(jìn)行提取，或者增加裂解的完全性
⑤某一種磁珠好，就應(yīng)該在所有實(shí)驗(yàn)中效果都好——磁珠和試劑體系都要一定時間的配合調(diào)整
⑥和某一種試劑盒相比不好，就是磁珠不好——不同磁珠適合的體系和用量是不同的，往往需要調(diào)整后才能獲得好效果。
5.苯酚氯仿法抽提法
苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，變性降解核蛋白，使DNA從核蛋白中游離出來。而DNA易溶于水，卻不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，也容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。利用萃取原理，根據(jù)蛋白核酸溶于不同的試劑層，將槍頭伸入不同液層內(nèi)抽取所需的成分，經(jīng)多次洗滌后獲得純化核酸。
