樣品材料非常珍貴，因此流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性至關(guān)重要。?但是質(zhì)量差的樣品會導(dǎo)致下游災(zāi)難性的結(jié)果，我們可以通過改進(jìn)流式細(xì)胞術(shù)樣品制備以獲得更可靠的結(jié)果。

無論在研究什么樣的細(xì)胞類型，如下樣本制備提示會有助于從流式實驗中獲得最大的收獲。

Part.1 確保培養(yǎng)細(xì)胞健康

培養(yǎng)的細(xì)胞對環(huán)境因素如溫度、pH和濕度極為敏感。因此，對于適合流式細(xì)胞儀實驗的培養(yǎng)箱而言，CO2培養(yǎng)箱的良好維護(hù)和不超載以及門的開度保持在最小值是至關(guān)重要的。細(xì)胞的行為也受到合流的影響，細(xì)胞保持對數(shù)生長非常重要，防止細(xì)胞死亡，也防止因此導(dǎo)致的成團(tuán)。在細(xì)胞需要傳代時，避免苛刻的離心和使用溫和的分離試劑如 Accutase?可以幫助減輕聚集。

Part.2 檢查細(xì)胞濃度

除了在常規(guī)繁殖過程中對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)以確認(rèn)生長是否如預(yù)期進(jìn)行外，計數(shù)對于確保實驗間樣品的一致性也至關(guān)重要。自動細(xì)胞計數(shù)器用于更可靠的計數(shù)和消除用戶偏差，將樣本保持在最佳細(xì)胞濃度范圍內(nèi)。如果細(xì)胞太多，分析中可能會丟失有價值的事件，細(xì)胞太少則會顯著延長運(yùn)行時間。

Part.3 考慮使用活性染料

同時測量細(xì)胞濃度和評估細(xì)胞活力有助于監(jiān)測細(xì)胞健康狀況。它還可以提醒研究人員注意樣品制備的任何有害影響，使研究方案能夠在早期適應(yīng)。吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）等試劑已成為廣泛使用的臺盼藍(lán)（如果使用不當(dāng)，臺盼藍(lán)可能具有細(xì)胞毒性）的首選替代品，并且容易與大多數(shù)自動計數(shù)系統(tǒng)兼容。

Part.4 確保處理的一致性

在許多情況下，細(xì)胞在流式細(xì)胞儀分析之前需要某種形式的處理。這可能是潛在的候選藥物的不同劑量，刺激特定的酶，或誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號通路。為了保證流式數(shù)據(jù)的質(zhì)量，這些處理方法必須在實驗之間保持一致。試劑添加通常涉及時間敏感的解凍步驟或極低體積的移液，為了提高實驗的重現(xiàn)性，研究人員經(jīng)常使用凍干粉狀、預(yù)先配制好的常用激活劑混合物，比如貝克曼庫爾特的DURActive stimulation kits，或者在方案中引入自動化液體處理系統(tǒng)。

Part.5 考慮富集稀有細(xì)胞群

目的細(xì)胞群含量很低時，可能需要進(jìn)行靶富集。低含量細(xì)胞群流式分析，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞或抗原特異性T細(xì)胞時，這種方法尤其有用。富集靶細(xì)胞的一種方法是磁珠富集，如美天妮的MACS? microbead technology。

Part.6 小心處理血液和組織樣本

處理培養(yǎng)細(xì)胞與處理血液和組織材料的主要區(qū)別在于如何采集樣本。血液和組織經(jīng)常從長期的大型隊列研究中獲得，要求在流式細(xì)胞術(shù)分析之前保存樣本。與樣品保存相關(guān)的變異性可以通過使用專門的組織儲存試劑、冷凍干燥和在-80℃保存材料來降低。組織隨后進(jìn)行機(jī)械離解，組織特異性離解緩沖液，如美天妮的組織離解試劑盒g(shù)entleMACS??解離劑可以更好地保留表位。

Part.7 過濾樣本以去除團(tuán)塊

通過適當(dāng)孔徑的細(xì)胞過濾器過濾樣本是一種快速簡便的方法，可以去除任何可能使下游分析復(fù)雜化或堵塞流式細(xì)胞儀的團(tuán)塊。幾乎所有的流式細(xì)胞術(shù)方案都可以從過濾樣本中獲益，而顯微鏡下的快速檢查將確認(rèn)沒有殘留的團(tuán)塊。

Part.8 防止細(xì)胞粘在一起

制備好了單細(xì)胞懸浮液，重要的是要防止細(xì)胞粘在一起。使用不含Ca2+/Mg2+且含有高達(dá)2%蛋白質(zhì)的再懸浮緩沖液。樣本中加入DNase也會有幫助，以清除任何釋放的DNA，這些DNA可能會導(dǎo)致團(tuán)塊的形成。另一點值得注意的是，細(xì)胞能夠結(jié)合到塑料制品；使用聚丙烯管可以幫助減少對管壁的結(jié)合。

Part.9 提前計劃免疫染色

多色免疫染色抗體的選擇和面板的設(shè)計非常重要，儀器配置和性能表現(xiàn)、抗體的克隆、抗原表達(dá)豐度、染料亮度和染料間的相互影響都是面板設(shè)計時需要考慮的因素。可以使用各個網(wǎng)站的相關(guān)工具幫助實現(xiàn)更好的面板設(shè)計，如FluoroFinder的光譜查看器（Spectra Viewer），可以在一個直觀的平臺上快速比較來自所有供應(yīng)商的800多種熒光色素，而FluoroFinder的面板生成器（Panel Builder）能夠利用100多家供應(yīng)商的最新熒光色素和抗體產(chǎn)品設(shè)計最佳的多色流式細(xì)胞術(shù)實驗。

Reference

https://fluorofinder.com/newsletter-tips-and-tools-for-flow-cytometry-sample-prep-success/

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