痕量檢測在環(huán)境科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、食品安全和病毒檢測等領(lǐng)域具有重要意義。特別是在生物標(biāo)志物的檢測中，臨床樣本中靶標(biāo)的含量通常很低，可能達(dá)到皮摩爾、飛摩爾甚至阿摩爾水平。例如，從各種組織分泌并在生物體液中循環(huán)的納米囊泡(外泌體)，它與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病相關(guān)，但患者血液中的腫瘤外泌體可能是單囊泡水平，這對現(xiàn)有的檢測方法提出了很大挑戰(zhàn)。表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)是一種強(qiáng)大的檢測工具，即使在單分子水平上也能檢測分子的光譜信號。由于其高靈敏度和分子特異性，它被廣泛應(yīng)用于生化分析，如農(nóng)藥殘留分析、病毒檢測、組織腫瘤識別，甚至生物成像。然而，單分子檢測仍然存在兩個障礙：超靈敏SERS傳感器的制備和納米結(jié)構(gòu)表面的單分子(SM)檢測，即實(shí)現(xiàn)單分子SERS成像。近年來，二維材料因其高載流子遷移率、優(yōu)異的光電活性和大比表面積而成為一種很有前景的SERS襯底。作為二維材料家族的新成員，黑磷(BP)納米片具有出色的近紅外吸收和高光熱轉(zhuǎn)換效率，已被用于場效應(yīng)晶體管、高效光熱癌癥治療和光聲生物成像。同時，BP的拉曼光譜只在500 cm?1以下有3個拉曼指紋峰，遠(yuǎn)離生物樣品的指紋區(qū)(600-1800 cm?1)，完全不會干擾生物標(biāo)志物的信號。因此，BP納米片是一種理想的SERS材料。然而，現(xiàn)有研究表明，BP的本征SERS增強(qiáng)因子較弱，非常有必要通過協(xié)同電磁增強(qiáng)(EM)和化學(xué)增強(qiáng)(CM)，以進(jìn)一步提高BP及其雜化納米材料的SERS靈敏度。

Visualized SERS ImAging of Single Molecule by Ag/Black Phosphorus Nanosheets

Chenglong Lin, Shunshun Liang, Yusi Peng, Li Long, Yanyan Li, Zhengren Huang, Nguyen Viet Long, Xiaoying Luo, Jianjun Liu, Zhiyuan Li, Yong Yang

Nano-Micro Letters (2022)14: 75

本文亮點(diǎn)

1.?Ag/BP-NS具備出色的表面增強(qiáng)拉曼散射性能和可視化單分子檢測能力。這種顯著的增強(qiáng)可歸因于R6G分子共振、光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移共振和電磁共振的協(xié)同共振增強(qiáng)。

2.?本研究提出了一種新的偏振-映射方法，可以快速篩選出單分子信號，證明了得到的光譜是由單分子發(fā)射的。

3.?結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)的方法可以實(shí)現(xiàn)對不同腫瘤外泌體的識別。

內(nèi)容簡介

中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所楊勇研究員等在本研究中開發(fā)了一種通過獨(dú)特的光還原將銀納米顆粒嵌入多層黑磷納米片(Ag/BP-NS)中的特殊納米結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)SM的可視化檢測和成像。如圖1所示，該多層結(jié)構(gòu)除了存在作為EM“熱點(diǎn)”的大量Ag納米顆粒(約50 nm)外，許多超小的Ag納米粒子(3-5 nm)附著在BP的表面和嵌入納米片，從而激活了Ag-P-R6G的光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移(PICT)通道并帶來巨大的CM增強(qiáng)。該基底可以在50微升10-20 mol/L的R6G溶液中檢測到單個R6G分子的清晰信號，是在已報(bào)道的SERS底物中本征靈敏度最高的一種基底。此外，研究提出了一種偏振-映射方法來實(shí)現(xiàn)單個R6G分子的可視化SERS檢測和拉曼成像。作為實(shí)際應(yīng)用，利用提出的SERS方案結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)方法可以識別單個腫瘤外泌體。該研究中二維Ag/BP-NS納米傳感器的制備和研究為SM的檢測和SERS成像提供了可靠的策略，具有良好的生物學(xué)應(yīng)用前景。

圖1. Ag/BP-NS SERS傳感器合成與應(yīng)用示意圖。

圖文導(dǎo)讀

I?Ag/BP-NS納米片表征

如圖2所示，在這項(xiàng)工作中合成的復(fù)合納米片與已報(bào)道的Ag/BP-NS復(fù)合材料有顯著不同。除了表面上的大銀納米粒子外，BP納米片的表面和插層之間還分布著許多超小的銀納米粒子。大多數(shù)銀納米顆粒(50-100 nm)很好地附著在BP納米片上(圖2a)。隨后，將Ag/BP-NS懸浮液稀釋并剝離納米片以暴露納米片內(nèi)層。如高角度環(huán)形暗場(HAADF)圖像(圖2c)所示，可以觀察到大量直徑約3-5 nm均勻分布的超小Ag納米顆粒緊密附著在表面或嵌入BP納米片。然而，在沒有光照的情況下合成的Ag/BP-NS樣品中幾乎沒有觀察到小尺寸的銀納米顆粒(圖2d)。這是由于BP納米片在光激發(fā)下可以產(chǎn)生大量的光生電子，使得Ag納米粒子的成核速度迅速提高，從而提高了溶液中Ag納米粒子的還原效率。此時一些成核納米粒子在溶液中Ag?耗盡之前將無法生長，因此超小的Ag納米粒子原位沉積在納米片的表面和插層。

圖2

為了研究Ag-BP的結(jié)合狀態(tài)，用X射線光電子能譜(XPS)分析了Ag/BP-NS中元素的表面組成和價(jià)態(tài)。圖3a顯示了130.1、130.9和134.5 eV三個峰，分別屬于樣品的P 2p3/2、P 2p1/2和微量的氧化磷(PxOy)。值得注意的是，與不含銀納米顆粒的黑磷相比，負(fù)載銀納米顆粒的BP納米片中氧化磷的峰值比例顯著增加(圖3b)，這表明黑磷在銀納米顆粒的原位還原中起到還原劑的作用。然而，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的BP和貴金屬復(fù)合材料的XPS結(jié)果相比，本研究制備的復(fù)合材料的P 2p峰清晰而尖銳。同時，氧化磷峰的峰比明顯低于p2p，表明納米片在合成和儲存過程中得到了很好的保護(hù)，保留了其獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)，避免了過度氧化。此外，Ag/BP-NS的XPS光譜在129.4 eV處顯示出一個子帶，這歸因于Ag-P的鍵合。在圖3c中，368.5 eV和374.5 eV的帶分別屬于Ag 3d5/2和Ag 3d3/2。與純BP和純Ag相比，在Ag/BP-NS的情況下，P 2p3/2 (130.2 eV)、P 2p1/2 (131.0 eV)的結(jié)合能存在0.1 eV的正位移，而Ag 3d的存在0.3 eV的位移，這可能是由于Ag和P原子之間的電荷轉(zhuǎn)移所致。高斯計(jì)算結(jié)果也支持Ag/BP-NS襯底上Ag原子和BP原子之間存在明顯的電荷轉(zhuǎn)移。

圖3

II?Ag/BP-NS納米片上的單分子檢測

未經(jīng)Ag修飾的BP納米片對R6G的最低檢測限(LOD)可以達(dá)到10?? M，無光照的情況下制備的Ag/BP-NS納米片上R6G的LOD僅為10?? M，這與相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果相似。而通過光還原制備的Ag/BP-NS顯示出極高的SERS靈敏度，LOD為10?2? M (圖4a)，是所有報(bào)道的SERS基底中靈敏度最高的之一，可以達(dá)到單分子的水平。同時，計(jì)算的最大增強(qiáng)因子(EF)在1507 cm?1處為0.101×1012，對應(yīng)于芳香環(huán)的C-C拉伸(圖4b)。

為了驗(yàn)證Ag/BP-NS的單分子檢測能力，進(jìn)行了以下驗(yàn)證。一般來說，如果探針分子的濃度小于10?11 M，在不考慮基底對探針分子富集的情況下，顯微拉曼測量區(qū)域(激光聚焦區(qū))中可檢測分子數(shù)僅有單個分子或幾個分子。如圖4a所示，這里收集了從10??到10?2??M的一系列濃度梯度的R6G分子的拉曼信號。需要注意的是，由于R6G分子的極化特性，在低濃度下R6G的指紋峰不會全部出現(xiàn)，只有分子極化方向與偏振光方向相同的振動才會被增強(qiáng)。圖4c-e給出了不同濃度(10?1?-10?2??M) R6G在Ag/BP-NS基底上的拉曼映射(Mapping)圖像和SERS成像結(jié)果。

圖4

在如此低的濃度下，可以排除分子聚集的干擾，所以可以認(rèn)為真正得到了單分子的信號。隨后，計(jì)算了Ag/BP-NS基板上R6G在1360 cm?1處的特征峰強(qiáng)度。如圖5a所示，拉曼信號在10??到10?1??M范圍保持很好的內(nèi)線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.94001。然而，當(dāng)濃度低于10?11?M時，獲得的探測信號不再與之前的數(shù)據(jù)線性相關(guān)。并且數(shù)據(jù)之間的強(qiáng)度波動變化不大，說明在出現(xiàn)信號的區(qū)域處只有一個或幾個R6G分子。然后，這里提出了一種偏振-映射方法來分析從超低濃度溶液中獲得的R6G信號是否由單分子發(fā)射。圖5b給出了偏振-映射策略的示意圖。R6G分子是不對稱的，所以分子具有極性。因此，其拉曼光譜具有偏振特性。如果拉曼光譜不是單分子發(fā)射的，而是大量分子吸附在基板上并隨機(jī)分布。那么采集到的分子信號在各個方向的極化張量是具有平均效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。因此，當(dāng)在光路中添加偏振片時，偏振光譜之間只會存在強(qiáng)度差異。相反，對于單分子偏振光譜，與偏振光方向不同的極化方向就不會被增強(qiáng)，所以光譜的差異不僅會表現(xiàn)在強(qiáng)度上，還會導(dǎo)致一些峰的消失和相對強(qiáng)度的變化。因此，可以通過研究R6G分子的偏振拉曼光譜來判斷信號是否是單分子發(fā)出的。

在這里，分別在激光器后方和信號收集器之前各放置一個偏振片，隨后通過mapping在10?1? M R6G樣本中掃描60×60 μm2的矩形區(qū)域并分析其中的清晰信號。通過轉(zhuǎn)動信號收集器前面的偏光片，使其與激光器后面的偏光片平行或垂直， R6G的平行和垂直偏振光譜均在同一點(diǎn)采集。如圖5c所示，將信號采集器前的偏振片旋轉(zhuǎn)90°后，部分指紋峰明顯消失，平行偏振光譜與垂直偏振光譜的特征峰的相對強(qiáng)度也發(fā)生了變化。這是由于偏光片濾掉了單分子在其他方向上的散射光子，該實(shí)驗(yàn)給出了單分子存在的重要證據(jù)。基于上述原理和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出了一種結(jié)合映射和偏振光譜來表征單分子的方法。如圖5d-f所示，在這里，我們采用1648 cm?1的拉曼強(qiáng)度進(jìn)行映射成像。當(dāng)沒有在光路中添加偏振片時，獲得了16個清晰的分子信號(圖5d)。在光路中加入偏振器后，指紋峰的變化反映在垂直偏振映射光譜中，部分信號消失(圖5e)。繼續(xù)旋轉(zhuǎn)偏振片，如圖5f所示，原本在垂直映射中出現(xiàn)的一些清晰信號也消失了。但無論是平行偏振光譜還是垂直偏振光譜，信號的位置都可以與未放置偏振片的光譜一一對應(yīng)。上述現(xiàn)象表明，可以實(shí)現(xiàn)基于Ag/BP-NS的單分子可視化檢測和表征。

圖5

III?SERS增強(qiáng)機(jī)制

如圖6a所示，分別通過(1)光還原法和(2)普通方法合成了Ag/BP-NS的懸濁液，以及通過(3)化學(xué)還原法合成了Ag的懸濁液。通過不同方法合成的Ag納米顆粒的尺寸相似(圖6b-e)。然而，通過光還原合成的雜化納米片的懸濁液外觀更接近銀膠體，既產(chǎn)生了更多的銀納米顆粒，這也由SEM圖像所證實(shí)(圖6b、d)。正如上面提到的，BP納米片在激發(fā)光下可以產(chǎn)生大量的光生電子，以提高Ag納米粒子的還原效率。因此，光還原方式帶來了像化學(xué)還原一樣更高的還原效率，必然會帶來更多的“熱點(diǎn)”。

圖6

如圖7a-c所示，通過有限差分時域(FDTD)模擬了BP納米片和Ag/BP-NS納米片的電磁場分布情況。BP的局部等離子體共振可以被532 nm入射光激發(fā)(圖7a)。隨后，計(jì)算了吸附在BP上的二聚體(Ag納米顆粒)。如圖7b所示，直徑為50 nm 的Ag顆粒提供了明顯的電磁增強(qiáng)。強(qiáng)耦合共振主要分布在二聚體(Ag納米粒子)的“間隙”和BP表面。根據(jù)SERS增強(qiáng)因子與局域電場增強(qiáng)因子的對應(yīng)關(guān)系，電磁可以提供大約10?的增強(qiáng)。

圖7

雖然直徑為5 nm的Ag納米粒子沒有提供明顯的電磁增強(qiáng)(圖7c)，但BP/Ag異質(zhì)結(jié)構(gòu)中高效的載流子遷移率可以有效地促進(jìn)化學(xué)增強(qiáng)過程和光活性。如圖8a所示，通過Gaussian計(jì)算的R6G光譜表明Ag4-P6簇中存在明顯的化學(xué)增強(qiáng)。更重要的是，Ag4-P6-R6G簇的計(jì)算帶隙(圖8b)更接近532 nm激光下的“帶隙共振”(2.33 eV)。

圖8

除了EM和CM的計(jì)算結(jié)果，下面又通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了該體系存在顯著的電荷轉(zhuǎn)移。如圖9a所示，Ag納米顆粒(約50 nm)由于等離子體共振和R6G在532 nm處的光吸收之間的耦合，可以強(qiáng)烈增強(qiáng)分子的拉曼信號。Ag納米粒子的光吸收在532 nm后逐漸下降(圖8c)。所以推測，在633和785 nm波長下增強(qiáng)效果會逐漸減弱。如圖9b所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果確實(shí)與預(yù)測結(jié)果一致。雖然Ag/BP-NS 的光吸收在785 nm處迅速下降，但在633 nm處并未下降。然而，在改變激發(fā)波長后，基底的增強(qiáng)作用迅速消失(圖9c、d)，這不符合EM定律。因此，在Ag/BP-NS中必然存在“帶隙共振”的化學(xué)增強(qiáng)。與未光照制備的納米片相比，光還原(hv)制備的Ag/BP-NS在633 nm激發(fā)光下仍保持一定的增強(qiáng)，這也證實(shí)了光還原可以給納米片帶來更多的“熱點(diǎn)”。此外，光還原基底的光吸收強(qiáng)度也顯著高于其他基底。總之，通過光還原制備的Ag/BP-NS具有三各方面的協(xié)同共振，包括Ag納米粒子周圍的電磁共振(約50 nm)、光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移共振(Ag-P-R6G簇)和分子共振。

圖9

IV?基于Ag/BP-NS的腫瘤外泌體檢測

外泌體來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體顆粒內(nèi)陷形成的微囊泡。它們攜帶反映細(xì)胞特征的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物的化學(xué)信息。因此，許多研究使用外泌體作為腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。然而，包括蛋白質(zhì)印跡或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在內(nèi)的傳統(tǒng)檢測方法需要復(fù)雜的程序或大量樣本進(jìn)行檢測。鑒于這些繁瑣的操作或有限的準(zhǔn)確性限制，傳統(tǒng)的外泌體分析方法在臨床診斷中存在許多障礙。所以SERS可能是一種理想的檢測方法，因?yàn)樗哂锌焖俸透哽`敏的檢測特點(diǎn)。這里選擇了A549(肺癌)和HCT-116(結(jié)腸癌)兩種來源的外泌體測試Ag/BP-NS對腫瘤外泌體的識別能力，檢測限可以達(dá)到5×10??particles/mL(人體血液外泌體濃度約為10??particles/mL)，即單囊泡水平。

最后利用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法進(jìn)行光譜識別，研究中選擇了兩種外泌體和PBS干擾各自100個光譜進(jìn)行訓(xùn)練和測試。隨機(jī)選擇300個光譜中的60%作為訓(xùn)練集，其余光譜作為測試集。如圖10a、b所示，經(jīng)過訓(xùn)練的模型在預(yù)測訓(xùn)練集和測試集時的靈敏度值分別為100%和99.17%。事實(shí)上，測試集中只出現(xiàn)了1例誤判，這表明Ag/BP-NS結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)方法具有在單囊泡水平上區(qū)分腫瘤外泌體的能力。

圖10

結(jié)論：研究通過光還原方法合成了一種獨(dú)特的Ag/BP-NS納米片。Ag/BP-NS表現(xiàn)出驚人的本征SERS靈敏度，EF為0.101×1012，LOD可以達(dá)到單分子水平。檢測過程無需任何物理富集，即可在10?2? M R6G 溶液中獲得清晰的單分子信號。Ag/BP-NS基底優(yōu)異的SERS增強(qiáng)能力來自于電磁共振、光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移共振和R6G分子共振的協(xié)同共振增強(qiáng)。此外，我們通過提出的偏振-映射光譜，實(shí)現(xiàn)了單個R6G分子在Ag/BP-NS上的精確定位和SERS成像。該基底在實(shí)際應(yīng)用中也具有優(yōu)異的性能，具有良好的生物相容性和均勻性。結(jié)合SERS成像和機(jī)器學(xué)習(xí)，可以區(qū)分和識別不同細(xì)胞系中的腫瘤外泌體。所制備的二維Ag/BP-NS具有單分子/囊泡檢測能力，結(jié)合其在腫瘤治療領(lǐng)域的優(yōu)異性能，有望建立獨(dú)特的腫瘤檢測和治療體系。

作者簡介

楊勇

本文通訊作者

中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所 研究員

▍主要研究領(lǐng)域

(1) 用于能源和環(huán)境的納米光電材料與納米生物傳感器件；(2) 激光與物質(zhì)表界面光學(xué)作用，陶瓷表面改性及光學(xué)薄膜；(3) 陶瓷增材制造科學(xué)與空間應(yīng)用。

▍個人簡介

中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所研究員，博士生導(dǎo)師，中國科學(xué)院杰出人才計(jì)劃和上海市浦江人才計(jì)劃。多年來主要從事納米生物傳感材料、增材制造空間光學(xué)陶瓷的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。作為首席科學(xué)家承擔(dān)國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)、國家重點(diǎn)研發(fā)國際合作、國家自然科學(xué)基金及高技術(shù)類項(xiàng)目20多項(xiàng)，累計(jì)科研經(jīng)費(fèi)超7000余萬元。在材料類頂級學(xué)術(shù)期刊Matter、Advanced Science、Nano Energy、Nano-Micro Letters及Additive Manufacturing等發(fā)表第一/通訊SCI論文130篇，多篇ESI高被引。獲得中國及日本授權(quán)發(fā)明專利15項(xiàng)，英文書章節(jié)3篇。以分會主席在國際航天會議、亞太陶瓷玻璃大會、中國納米年會等做邀請報(bào)告30余次。

本信息源自互聯(lián)網(wǎng)僅供學(xué)術(shù)交流 ，如有侵權(quán)請聯(lián)系我們立即刪除。