凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）可以： （1）研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用； （2）可用于DNA定性和定量分析； （3）用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 ???????凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異）， 和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。 DNA樣品 [γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶緩沖液、醋酸銨、TE、無水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、過硫酸銨、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift結(jié)合緩沖液、溴酚藍(lán)等 水浴鍋、PCR儀、離心機(jī)、電泳儀、電泳槽等

一、探針的標(biāo)記

1. 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系： （1）待標(biāo)記探針 (1.75 pmol/微升) ：2微升。 （2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。 （3）Nuclease-Free Water ：5微升。 （4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。 （5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。 （6）總體積：10微升 （7）按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。 2. 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。 3. 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。 4. 再加入89微升TE，混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡便起見，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。 5. 標(biāo)記好的探針好立即使用，長使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

二、 探針的純化

通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作 1. 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。 2. 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀過夜。 3. 在4℃，12 000 g-16 000 g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。 4. 在4℃，12 000 g-16 000 g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。 5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針好立即使用，長使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在 -20℃。

三、EMSA 膠的配制

1. 準(zhǔn)備好倒膠的模具。可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞?。好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。 2. 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大)。 （1）TBE buffer (10X)： 1毫升。 重蒸水：16.2毫升。 （2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。 （3）80% 甘油： 625微升。 （4）10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) ：150微升。 （5）TEMED ：10微升 3. 按照上述次序加入各個(gè)溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。

四、EMSA結(jié)合反應(yīng)

1. 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng) 陰性對(duì)照反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：7微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 0微升。 （4）標(biāo)記好的探針 ：1微升。 （5）總體積 ：10微升。 樣品反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：5微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。 （4）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （5）總體積： 10微升。 探針冷競(jìng)爭反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 2微升。 （4）未標(biāo)記的探針： 1微升。 （5）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （6）總體積 ：10微升。 突變探針的冷競(jìng)爭反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。 （4）未標(biāo)記的突變探針： 1微升。 （5）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （6）體積 ：10微升 Super-shift反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。 （4）目的蛋白特異抗體 ：1微升。 （5）標(biāo)記好的探針：1微升。 （6）總體積 ：10微升。 2. 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。 3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對(duì)于使用無色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。

五、 電泳分析

1. 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。 2. 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。 3. 按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。 4. 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。 5. 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。