導讀：

人牙髓間充質(zhì)干細胞(hDPSCs)是臨床治療中較好的細胞來源，具有高增殖能力、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)能力等多種優(yōu)點，hDPSCs一般在含有胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中進行分離和擴增，但是出于安全性的考慮，迫切需要在符合標準生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的環(huán)境下進行培養(yǎng)，所以選擇一款不含血清的培養(yǎng)基并評價其性能將是至關重要的。

小編今天將帶領大家對比一下符合GMP的無異種血清培養(yǎng)基(AMMS?MSC試劑盒套裝2.0，AS-13）與含血清培養(yǎng)基(SCF)培養(yǎng)hDPSCs的效果差異。

人牙髓間充質(zhì)干細胞(hDPSCs)來源于9顆正畸牙齒(杭州口腔醫(yī)院正畸科)，hDPSCs分別平行在兩種培養(yǎng)基中進行分離與培養(yǎng)，主要通過實驗：集落形成單位(CFU)試驗、流式細胞儀免疫表型分析、三系分化分析、神經(jīng)細胞定向分化試驗、熒光倒置顯微鏡觀察、實時聚合酶鏈反應、SA-β-gal分析等實驗系統(tǒng)比較了這兩種培養(yǎng)基的細胞特性，包括形態(tài)、增殖、標記表達、分化、干細胞、衰老和細胞因子分泌等各項指標。

01、分離與擴增

在兩種培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的hDPSCs粘附在培養(yǎng)皿的底部，并顯示出典型的紡錘形形態(tài)，但AMMS的細胞更細長，P1代SCM和AMMS培養(yǎng)的細胞PDT分別為28.11±4.50h和28.55±3.10h(p=0.625)。隨著傳代的進行，兩種培養(yǎng)基中細胞的PDT逐漸增加，SCM中細胞的PDT增加更快。到P5時，SCM中細胞的PDT顯著升高。側(cè)面說明顯示AMMS有更高的分離成功率。

02、CFU

CFU形成是細胞系增殖或自我更新能力的良好指標。在這項研究中，我們計算了P2和P5的hDPSCs形成的細胞集落數(shù)。分析表明，在SCM和AMMS培養(yǎng)的hDPSCs之間，以及在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的P2和P5的hDPSCs之間，CFU形成率沒有顯著差異。在SCM中培養(yǎng)的細胞形成的集落更立體和聚集，而在AMMS中培養(yǎng)的細胞形成的集落扁平、松散和更大。這可能表明在AMMS培養(yǎng)的細胞具有更高的增殖能力。

03、內(nèi)皮祖細胞的免疫表型

根據(jù)ISCT對骨髓間充質(zhì)干細胞的定義，我們用流式細胞儀檢測了P2和P5的hDPSCs的免疫表型，包括CD73、CD90、CD105、CD45、CD14、CD19、CD34、HLA-DR，>95%，幾乎不表達CD45、CD14、CD19、CD34和HLA-DR<2%。統(tǒng)計分析顯示，在SCM和AMMS中培養(yǎng)的細胞之間的表達百分比沒有顯著差異(所有p> 0.05)，以及在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的P2和P5的細胞之間沒有差異。

SCM:含血清培養(yǎng)基；? AMMS:無血清/異種培養(yǎng)基（同立海源生物）

04、干性和衰老分析

干性保持是評估細胞質(zhì)量和細胞制造過程適用性的一個很好的特征。在這里通過實時PCR檢測多潛能標記基因的表達NANOG、OCT4和SOX2。P2和P5的細胞在SCM和AMMS培養(yǎng)的細胞中，這三種基因的表達都沒有表現(xiàn)出任何差異。然而培養(yǎng)至P5時，確實導致了SCM中SOX2的表達(p=0.002)。這些結(jié)果可能反映了當細胞在AMMS培養(yǎng)時，干細胞保持得稍好。通過基于SA-β-gal活性的染色來檢測擴增期間的細胞衰老，檢測表明衰老細胞的比例很低(SCM:9.92±2.54%；AMMS:10.03±2.81%)。

(a) 在P2和P5的SCM和AMMS中培養(yǎng)的細胞之間的相對mRNA表達比較(在P2的SCM中培養(yǎng)的不同基因的表達作為對照)；

(b) SA-β-GAL染色(藍色細胞表示衰老)；

(c) 當在SCM中培養(yǎng)時SA-β-gal陽性細胞與總細胞的比率與P5時AMMS的比較(p=0.97)(比例尺=200微米)；

SCM:含血清培養(yǎng)基；? AMMS:無血清/異種培養(yǎng)基（同立海源生物）

05、細胞因子分泌

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測P5細胞分泌的細胞因子，包括HGF、FGF2、BDNF、GDNF、IL-6、IL-10、PGE2和TGFβ1。結(jié)果顯示，與SCM培養(yǎng)的細胞相比，AMMS培養(yǎng)的細胞HGF的表達較高，而PGE2和TGFβ1的表達較低。這些數(shù)據(jù)表明，與SCM中分離的hDPSCs相比，在AMMS分離的hDPSCs表現(xiàn)出更高的增殖和自我更新能力。

06、體外三系分化潛能

許多研究證明了hDPSCs向骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的分化能力.茜素紅染色顯示，在兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hDPSCs在誘導后顯示出大量的礦物質(zhì)沉積，但是成骨標記物(ALP和RUNX)是在AMMS擴大的hDPSCs中檢測到的。與先前的研究一致，在SCM中培養(yǎng)的hDPSCs顯示出有限的成脂分化潛能，但在AMMS擴增的hDPSCs表現(xiàn)出更明顯的脂滴染色和更高的標記基因(LPL和PPARγ)成脂誘導下的表達?？偟膩碚f，在AMMS擴增的hDPSCs比在SCM中擴增的顯示出更高的成骨和成脂潛能。

P5時在SCM和AMMS中培養(yǎng)的hDPSCs的三系分化潛能

(a)分別用茜素紅、油紅O和阿利新藍染色顯示hDPSCs的成骨、成脂和成軟骨能力；

(b)成骨相關基因(ALP，RUNX2)的相對mRNA表達水平；

(c)成脂相關基因(LPL，PPARγ)的相對mRNA表達水平；

(d)軟骨形成相關基因(ACAN，SOX9)的相對mRNA表達水平(比例尺=200微米，*p<0.05)；

人類牙髓干細胞；

SCM:含血清培養(yǎng)基；? AMMS:無血清/異種培養(yǎng)基（同立海源生物）

總結(jié)

所以綜合來看，相比SCM，AMMS更有優(yōu)勢，并且在現(xiàn)行的管理體系下，無血清培養(yǎng)基替換含血清培養(yǎng)基是大勢所趨，不僅提高了細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了由于血清批次之間差異的影響，減少了由血清帶來病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險、血清中某些因素對有些細胞的毒性、血清中蛋白對某些生物測定的干擾，更有利于對實驗結(jié)果的分析等等。

同立海源AMMS??MSC試劑盒套裝2.0，適用于原代及凍存間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)擴增，成分明確，穩(wěn)定性高，操作簡單，無需添加谷氨酰胺，無血清，無異源成分，擴增效率高，表型穩(wěn)定。產(chǎn)品已通過美國FDA的DMF備案(035589)，干細胞藥物臨床實驗最佳選擇。

參考文獻：

1.?JUAN LI,?XUEWEI LV,?TINGTING GEC,?JIAMAN SHI,GIDEON VERWOERD,HAIYAN LIN and ?YUANSONG YU,?Improved Cell Properties of Human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) Isolated and Expanded in a GMP Compliant and Xenogeneic Serum-free Medium.

關于同立海源

北京同立海源生物科技有限公司，專注細胞和基因治療（CGT）上游GMP級原料試劑研發(fā)及生產(chǎn)，為CGT用戶提供產(chǎn)品與服務的整體解決方案。產(chǎn)品涉及細胞分選磁珠試劑、真核/原核重組蛋白、無血清培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)試劑盒等。

公司建有3200㎡的研發(fā)實驗室及GMP級潔凈車間，包括細胞分選磁珠開發(fā)平臺、真核與原核蛋白表達工程平臺、無血清培養(yǎng)基開發(fā)平臺，通過ISO13485和ISO9001雙質(zhì)量體系認證，部分產(chǎn)品已獲美國FDA DMF備案。