實(shí)驗?zāi)康模?/p>

本實(shí)驗方案參照10X Genomics的barcode凝膠珠制備方法，以微滴/微球制備儀為驅(qū)動裝置，以丙烯酰胺混合液為水相(分別以丙烯酰胺和N,N′-雙(丙烯酰)胱胺作為單體和交聯(lián)劑)，以含有N, N, N′, N′-四甲基乙二胺的Drop-Surf微滴生成油為油相，制備含有Oligo DNA的高單分散可降解聚丙烯酰胺凝膠珠(CV<5%)，封裝前后Oligo Oligo DNA濃度交聯(lián)率高達(dá)40%以上。

引言：

細(xì)胞作為生物結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，在形態(tài)類型上差異很大。結(jié)合高通量測序，基于液滴的單細(xì)胞測序技術(shù)被成功應(yīng)用于分析單細(xì)胞中的RNA

[1-3]

、DNA

[4,5]

和蛋白質(zhì)

[6,7]

等組分。為了標(biāo)記追蹤單個細(xì)胞，需要將含有DNA barcode的凝膠珠與單個細(xì)胞共同封裝在納升級的液滴中，以便用于后續(xù)的單細(xì)胞分析測序

[8]

。而如何將合成的DNA barcode添加到凝膠珠上是實(shí)現(xiàn)這項技術(shù)的關(guān)鍵?，F(xiàn)已報道的制備添加DNA barcode的方法有inDrop單細(xì)胞測序的聚丙烯酰胺膠珠

[2]

、Drop-seq單細(xì)胞測序的羥化甲基丙烯酸聚合物凝膠珠

[3]

和10X Genomics使用的聚丙烯酰胺凝膠珠

[8]

等。 然而，上述方法制備的膠珠由于化學(xué)成分不同，其優(yōu)缺點(diǎn)有明顯差異。例如，inDrop系統(tǒng)中可實(shí)現(xiàn)95%以上的膠珠包裹率，但DNA barcode的釋放需要通過紫外線輔助釋放，這在一定程度上增加了引物的釋放難度

[2]

。同時，紫外線也有可能對DNA或RNA造成不可逆的傷害。Drop-seq系統(tǒng)中雖無上述問題，但引物不會從膠珠中釋放，這使得反應(yīng)僅在膠珠表面進(jìn)行，降低了反應(yīng)效率。在10X Genomics系統(tǒng)中，膠珠可以實(shí)現(xiàn)有效的包裹和釋放，但相對較高的成本和膠珠上引物設(shè)計缺乏靈活性限制了一些實(shí)驗的開展。因此，當(dāng)前的主要難點(diǎn)是制備出簡易高效向液滴輸送含有barcode凝膠珠，從而實(shí)現(xiàn)高檢測效率。 FluidicLab基于Wang等人的研究

[9]

，參照10X Genomics的barcode凝膠珠制備方法，提供了一種含有Oligo DNA聚丙烯酰胺可降解凝膠珠的實(shí)驗方案。本實(shí)驗方案以丙烯酰胺混合液為水相(分別以丙烯酰胺和N,N′-雙(丙烯酰)胱胺作為單體和交聯(lián)劑)，以含有N, N, N′, N′-四甲基乙二胺的Drop-Surf微滴生成油為油相，制備含有Oligo DNA的高單分散可降解聚丙烯酰胺凝膠珠。所制備的膠珠可以通過二蘇硫醇(DTT)打開交聯(lián)劑N,N′-雙(丙烯酰)胱胺中的二硫鍵，使得其被完全降解，從而釋放出DNA barcode(機(jī)理如下圖所示

[9]

，發(fā)生聚合反應(yīng)時以過硫酸銨(APS)作為催化劑，以N, N, N′, N′-四甲基乙二胺(TEMED)作為催化加速劑)，通過檢測封裝前后Oligo DNA濃度可知其交聯(lián)率高達(dá)40%以上。

實(shí)驗材料：

試劑盒

：

微滴生成油(Drop-Surf,?FluidicLab) 破乳劑(Drop-Surf,?FluidicLab)

TBSET緩沖液(FluidicLab)

40%丙烯酰胺溶液(wt%, FluidicLab)

0.8% N,N′-雙(丙烯酰)胱胺溶液(wt%, BAC,?FluidicLab)?

過硫酸銨(APS, FluidicLab)

N, N, N′, N′-四甲基乙二胺(TEMED, FluidicLab)

1% Span 80的正己烷溶液(v/v, FluidicLab)

TET緩沖液(FluidicLab)

Qubit ssDNA檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific)

10 mM 二蘇硫醇溶液(DTT?, FluidicLab)

耗材

：

15 mL離心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干 1.5 mL離心管若干

內(nèi)/外徑0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接頭

0.22 μm針式過濾器(PTFE材質(zhì))若干

芯片夾具

：

PDMS-FF-50 μm 超疏水芯片(FluidicLab) PDMS標(biāo)準(zhǔn)芯片夾具

設(shè)備

：

Fluidiclab微滴/微球制備儀(兩通道) 電腦(Win10 以上系統(tǒng))

高速離心機(jī)(湖南湘儀, H1850)

普通光學(xué)顯微鏡(用于測微球粒徑)

Qubit 4熒光檢測儀

實(shí)驗步驟：

1.?試劑配制：

具體操作步驟如下(參考視頻：

微流控應(yīng)用：微滴/微球制備儀制備含Oligo DNA的可降解凝膠珠

)： (1) 10%(w/v)過硫酸銨溶液配制: 稱量約0.1 g 過硫酸銨，加入超純水振蕩溶解，最終定容至1 mL備用。 (2) 含有Oligo DNA的水相配制 依次取200 μL TBSET緩沖液、300 μL 40%(wt%)丙烯酰胺溶液、980 μL 0.8% (wt%) N,N′-雙(丙烯酰)胱胺溶液和120 μL 10%(w/v)過硫酸銨溶液混合均勻，并用0.22 μm的針式過濾器過濾處理備用； 再依次取上述配制好的800 μL丙烯酰胺混合液、166 μL 濃度為150 μM的Oligo DNA和34 μL超純水混合均勻得到1 mL含有Oligo DNA的水相溶液，最終配制成分如下表所示：

(3) 水相中Oligo DNA濃度的檢測： 取5 μL上述配制的含有Oligo DNA水相溶液，加入45 μL超純水將其稀釋10倍，振蕩均勻備用； 依次取298.5 μL Qubit ssDNA Buffer和1.5 μL Qubit ssDNA Reagent混合均勻得到Qubit ssDNA檢測試劑備用。 依次取上述配制的199 μL Qubit ssDNA檢測試劑和1 μL 上述配制的含有Oligo DNA的水相稀釋液混合均勻，并靜置2 min；用Qubit 4檢測其濃度。 (4) 油相配制： 按1000:4 (v/v)的體積比在3 mL微滴生成油中加入12 μL TEMED，并振蕩均勻。

2.?含有Oligo DNA膠珠的制備和固化：

(1) 微滴/微球制備儀的安裝連接 微滴/微球制備儀安裝連接參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“2. 微滴/微球制備儀的安裝連接”的部分；其連接如下(步驟③-⑦連接效果如下圖所示)：

①?用氣管依次連接“空氣壓縮機(jī)”--“氣源處理裝置”--“微滴/微球制備儀”； ②?將微滴/微球制備儀分別與電源、電腦的連接； ③?用氣管分別將A

0

(壓力輸出通道一)和A

1

(油相15 mL儲液池)，B

0

(壓力輸出通道二)和B

1

(水相1.5 mL儲液池)連接； ④?用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A

1

(油相15 mL儲液池)和A

2

(通道一流量傳感器)，B

1

(水相1.5 mL儲液池)和B

2

(通道二流量傳感器)連接； ⑤?用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A

2

(通道一流量傳感器)和A

3

(PDMS芯片的油相入口)，B

2

(通道二流量傳感器)和B

3

(PDMS芯片的水相入口)連接； ⑥?C為標(biāo)準(zhǔn)PDMS-FF-50超疏水芯片和夾具組合，芯片和夾具的入口通過硅膠塞密封； ⑦?用PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)將芯片出口D處生成的乳液導(dǎo)出。 (2)?FluidicLabSuite軟件的安裝和設(shè)備的添加： FluidicLabSuite軟件的安裝參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite軟件的安裝”的部分； (3)?含有Oligo DNA膠珠的制備和固化： 具體操作步驟如下(參考視頻“

微流控應(yīng)用：微滴/微球制備儀制備含Oligo DNA的可降解凝膠珠

”)： ①?在通道一的儲液池(油相)中加入上述配制的油相，通道二的儲液池(水相)中加入上述配制的含有Oligo DNA的水相； ② 打開空氣壓縮機(jī)及氣源處理開關(guān)； ③ 在電腦端設(shè)置通道一(油相)和通道二(水相)壓力排出管路及芯片中的空氣，待空氣排出(管路及芯片充滿液體)后，設(shè)定油相和水相流速分別為20和10 μL/min； ④ 按《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》調(diào)整流速增加反饋值(Feedback)以快速達(dá)到預(yù)定設(shè)置值； ⑤ 待微液滴生成穩(wěn)定后，用疏水培養(yǎng)皿接收液滴用并顯微鏡觀察其均勻性； ⑥ 微液滴穩(wěn)定生成后，即可開始接收至離心管中，20 min后停止收集； ⑦ 將接收至離心管中的乳液表面覆蓋200 μL 礦物油，并放置于65 °C鼓風(fēng)干燥箱中過夜固化。

3. 含有Oligo DNA膠珠的破乳清洗：

具體操作步驟如下(參考視頻“

微流控應(yīng)用：微滴制備儀制備含Oligo DNA的可降解凝膠珠

”)： ①?取出1.5 mL離心管底部油相和上層礦物油； ②?按V

球?

:?V = 1:2 加入破乳劑，振蕩破乳；5000 rpm離心處理30s，取出底部廢液；重復(fù)上述操作2~3次，直到微球由乳白色變?yōu)橥该鳎? ③?按V

球?

:?V = 1:2 加入?1% Span80的正己烷溶液，振蕩均勻；5000 rpm離心處理30s，取出上部廢液；重復(fù)上述操作2~3次； ④?按V

球?

:?V = 1:3 加入TET緩沖液，振蕩均勻，5000 rpm離心處理5min，取出上層廢液；重復(fù)上述操作1~2次； ⑤?最終分散于TET緩沖液中，得到固化后的聚丙烯酰胺微球。

4.?膠珠中Oligo DNA濃度檢測：

具體操作步驟如下(參考視頻“

微流控應(yīng)用：微滴制備儀制備含Oligo DNA的可降解凝膠珠

”)： ①?取5 μL上述制備的膠珠，加入45 μL濃度為10 mM的DTT溶液，振蕩均勻，靜置約10 min，等待膠珠完全溶解；??????????? ②?配制Qubit ssDNA檢測試劑，依次取298.5 μL Qubit ssDNA Buffer和1.5 μL Qubit ssDNA Reagent混合均勻； ③?依次取上述配制的199 μL Qubit ssDNA檢測試劑和1 μL 上述上述配制的膠珠溶解液混合均勻，并靜置2 min； ④?用Qubit 4檢測其濃度。

5. 微滴/微球制備儀清洗：

微滴生成儀每次使用完必須清洗管路、流量傳感器和芯片。 具體操作詳見“微滴/微球制備儀操作指導(dǎo)卡”。

結(jié)果與討論：

①?用Qubit 4檢測上述配制水相中的Oligo DNA濃度，儀器顯示結(jié)果為14.9 μg /mL (24.35 μM，單位轉(zhuǎn)換公式：)。 ②?剛接收的微滴平均粒徑為45.16 μm，具有極高的單分散性(變異系數(shù):CV=2.65%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：

③?固化后，最終獲得的含有Oligo DNA膠珠的平均粒徑為53.64?μm，具有極高的單分散性(變異系數(shù):CV=3.88%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：

④?用Qubit 4檢測上述溶解后膠珠中的Oligo DNA濃度，儀器顯示結(jié)果為6.48μg /mL (10.58 μM，單位轉(zhuǎn)換公式：)。 ⑤?通過檢測封裝前后Oligo DNA濃度可知其交聯(lián)率高達(dá)44.35%。

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