?1.1. 酵母、細(xì)菌基因組 DNA 提取?

1．1 ml 菌體發(fā)酵液，10000rpm 離心 10 min，去上清液；?

2．加 500 uL TE 懸浮沉淀，并加 10-20 uL Lysozyme 混勻，37 度保溫 0.5 h；?

3．加 30 uL10%SDS，3 uL 20ug/ml（或 1 mg 干粉）蛋白酶 K，混勻，37 度保溫 1 h；

?4．加 100 ul 5 mol/L NaCl 混勻；?

?5．加 8 ul CTAB/NaCl 溶液，混勻，65 度保溫 10 min；

6．用等體積酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）抽提，10000rpm 離心 5min，將上清液移至干凈離心管中；

7．用等體積氯仿：異戊醇（24：1）抽提，10000rpm 離心 5 min，取上清液移至干凈離心管中；?

8．加等體積異丙醇，顛倒混合，-20 度靜止 20 min，沉淀 DNA，10000rpm 離心 5min；

?9．倒出上清液，DNA 沉淀用 70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于 50 uL TE；?

10．最后貯存液中加入 1 uL RNase。 結(jié)果 通?？色@得 3-5ugDNA。?

?討論?

1．在培養(yǎng)箱溫度不夠穩(wěn)定等因素的影響下，有時(shí)隔夜后沒(méi)有菌落形成，此時(shí)不必急于懷疑實(shí)驗(yàn)失敗。建議再 倒置培養(yǎng)一些時(shí)候，比如等到中午，或更晚一些時(shí)候，培養(yǎng)皿上會(huì)出現(xiàn)菌落。

?2．挑取菌落必須是單菌落，而不是那些融合的菌落。如果培養(yǎng)皿上的菌落全部融合，則建議重新劃板培養(yǎng)， 直至有單菌落為止。不然一旦混有不同的菌落，可能會(huì)給以后的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)麻煩。

?3．有關(guān)微型離心柱回收的利弊。原理與本實(shí)驗(yàn)近似，區(qū)別在于在 DNA 的回收階段，不是采用醋酸鈉-乙醇沉 淀，而是采用微型柱?；厥债a(chǎn)物中往往留有痕量乙醇，這將妨礙一些對(duì)乙醇敏感的酶的活性，使后續(xù)工作困難。 ?

4．離心要求平衡。方法是保證離心機(jī)轉(zhuǎn)子對(duì)面兩側(cè)的試管孔內(nèi)有含有相等數(shù)量的離心物和試管，使兩側(cè)平衡。 如果僅有一個(gè)離心管，則要求對(duì)面放置另一根相同規(guī)格的離心管，管內(nèi)加入與樣品數(shù)量相等的水。 ?

5．DNA 的離心通常采用 1.4 萬(wàn)轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速，10 分鐘的時(shí)間，這足以滿(mǎn)足沉淀 DNA 的要求。

? 6．沉淀 DNA 或 RNA 離心時(shí)，應(yīng)把 Eppendorf 管蓋的連接蒂指向外側(cè)，以保證離心后沉淀位于管底靠連接蒂 的一側(cè)，當(dāng) DNA 或 RNA 量少至難以辨認(rèn)時(shí)，吸取上清之際，可避免吸頭觸及這一區(qū)域把所需沉淀吸起。

?7．室溫下，DNA 沉淀容易浮起，所以整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)保持在 4℃環(huán)境下進(jìn)行，手指持試管上部，切勿接觸試 管底部。?

8．吸取上清時(shí)動(dòng)作要輕而快，加入 75％乙醇時(shí)，應(yīng)將乙醇沿管壁輕輕加入，以免將沉淀沖起。

?9．通常，實(shí)驗(yàn)對(duì) RNA 污染不是有嚴(yán)格要求的話(huà)，比如做酶切鑒定的話(huà)，實(shí)驗(yàn)步驟（加 TE、RNase、NaAC 等）可以免去。這樣可以提高實(shí)驗(yàn)速度。

?10．離心后大腸桿菌的裂解物會(huì)黏附于管壁和浮于離心液表面，為避免大腸桿菌的裂解物堵塞吸頭，可以一面 將吸頭推出氣體，一面插入表面含有大腸桿菌的裂解物的離心液。

11．加入溶液 I 前，可用 200μl 槍頭將菌液吸干凈。

?12．加入溶液Ⅱ、Ⅲ后，應(yīng)輕輕顛倒混勻，切忌劇烈震蕩混勻，否則容易打斷 DNA。

?13．單純乙醇沉淀效差，可考慮加醋酸鈉等鹽。加 75％乙醇是為了清洗菌斑，若菌斑中還有無(wú)機(jī)鹽，25％的 水可以把無(wú)機(jī)鹽溶解出來(lái)，乙醇可把有機(jī)溶劑置換出來(lái)。?

? 14．65℃水浴時(shí)要打開(kāi)蓋子，這樣可以使乙醇等揮發(fā)掉。

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