雙膦酸鹽被廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥、癌癥中的骨轉(zhuǎn)移瘤和其他一些骨骼疾病中，但在治療過(guò)程中會(huì)對(duì)骨骼吸收產(chǎn)生抑制效果，最終引發(fā)雙膦酸鹽相關(guān)性頜骨骨壞死(bisphosphonate related osteonecrosis of the jaw,BRONJ)。作為口腔科最常見(jiàn)的術(shù)后疾病之一，常規(guī)拔牙等牙科手術(shù)明顯增加了BRONJ的發(fā)病率。其主要發(fā)病原因是由于注射雙膦酸鹽降低了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)活性，限制了內(nèi)源性NO的產(chǎn)生，影響了NO對(duì)破骨細(xì)胞的分化和活化。

2023年2月21日，由首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔健康北京實(shí)驗(yàn)室和首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室等合作完成，發(fā)表在Cell Proliferation上的題為“Dietary nitrate improves jaw bone remodelling in zoledronate-treated mice”的研究論文（IF：8.755）。該研究通過(guò)建立BRONJ模型，研究膳食硝酸鹽對(duì)唑來(lái)膦酸鹽處理后小鼠頜骨重塑的影響，并結(jié)合血液中單核細(xì)胞的非靶向代謝組學(xué)分析（青蓮百奧提供技術(shù)支持）及單核細(xì)胞活力測(cè)定，探究供給膳食硝酸鹽對(duì)小鼠BRONJ樣病變的影響。

實(shí)驗(yàn)處理

(1)對(duì)照組，只拔除小鼠右側(cè)上頜第一磨牙;(2) Z組，注射唑來(lái)膦酸鈉并拔牙;(3) Z + Nit組，注射唑來(lái)膦酸鈉和4 mM硝酸鈉。

結(jié)果速遞

1.膳食硝酸鹽可改善唑來(lái)膦酸鈉給藥后小鼠拔牙槽骨創(chuàng)面愈合

通過(guò)建立BRONJ模型，如圖1A所示。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在飲用水中添加4 mM的硝酸鹽顯著增加了血漿(圖1B)和牙槽周?chē)M織(圖1C)中的NOx含量。MicroCT分析和組織病理學(xué)染色(圖1D-F)顯示，拔牙后5周，Z + Nit組的骨愈合明顯優(yōu)于Z組。

拔牙后結(jié)束給藥(圖2A)。Z組出現(xiàn)牙槽延遲愈合，上皮覆蓋不完全等現(xiàn)象。而Z +Nit組和對(duì)照組愈合率更好（圖2B, C)。對(duì)上頜骨玻片進(jìn)行HE染色和三色染色后，與Z組相比，Z+Nit組壞死骨(%)和空腔隙區(qū)膳食硝酸鹽含量顯著降低(圖2D,?F)，骨臼藍(lán)染區(qū)域顯著增加(圖2G, H)。TRAP染色顯示，膳食硝酸鹽恢復(fù)了唑來(lái)膦酸鹽誘導(dǎo)的骨臼骨表面破骨細(xì)胞的減少(圖2I, J)。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到Z + Nit組骨臼周?chē)M織中CTX-1和traphospylated 5b水平顯著升高(圖2K)。膳食硝酸鹽調(diào)節(jié)了成骨和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。

2.?膳食硝酸鹽可調(diào)節(jié)拔牙后牙槽及周?chē)M織的免疫微環(huán)境

如圖3A, C所示，與對(duì)照組相比，注射唑來(lái)膦酸鈉增加了Z組外周血成熟單核細(xì)胞出現(xiàn)頻率。相比之下，Z + Nit組單核細(xì)胞出現(xiàn)頻率降低。然而兩組間牙槽內(nèi)及周?chē)M織中單核細(xì)胞的出現(xiàn)頻率無(wú)顯著性差異(圖3B,D)。與Z組相比，Z + Nit組組顯著提高了單核巨噬細(xì)胞的存活率和分化率(圖3E-H)。此外，膳食硝酸鹽可有效降低牙槽內(nèi)和周?chē)M織中TNF-α、IL-17A和IL-6水平，并提高被唑來(lái)膦酸鈉降低的IL-10、IFN-γ和IL-27水平(圖3I)。在拔牙早期，膳食硝酸鹽可以保護(hù)單核細(xì)胞并調(diào)節(jié)拔牙后牙槽的免疫微環(huán)境。

3.?膳食硝酸鹽誘導(dǎo)的單核細(xì)胞代謝組學(xué)

在飲用水中添加4 mM的硝酸鹽可以顯著增加血漿中NO的含量(圖4A)。結(jié)合非靶向代謝組學(xué)，PCA評(píng)分圖顯示對(duì)照組、Z組和Z + Nit組存在明顯分離(圖4C)。與Z組相比，Z + Nit組有889種代謝物發(fā)生了顯著變化，208種代謝物表達(dá)水平上調(diào)，681種表達(dá)水平下調(diào)(圖4D)。通過(guò)人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Metabolome Database)進(jìn)行分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)Z + Nit組與Z組相比，顯著差異的代謝物主要為脂質(zhì)和類(lèi)脂分子(圖4E)。進(jìn)行LIPIDMAPS分類(lèi)注釋?zhuān)越沂鞠嚓P(guān)的脂質(zhì)分類(lèi)(圖4F)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，Z + Nit?和?Z組顯著富集的途徑是necroptosis途徑。這些途徑和代謝調(diào)節(jié)共同作用改變單核細(xì)胞功能，從而改變周?chē)拿庖攮h(huán)境(圖4G)。

4.NO處理對(duì)唑來(lái)膦酸鈉誘導(dǎo)的單核細(xì)胞具有保護(hù)作用

從C57/B6小鼠中分離單核細(xì)胞，并用10 μM唑來(lái)膦酸鈉處理，并添加SNP（NO供體，在培養(yǎng)中提供外源性NO）和CP（NO清除劑，用來(lái)阻斷單核細(xì)胞中的NO），如圖5A所示。唑來(lái)膦酸鈉刺激24 h后，NO水平顯著降低?(圖5B, C)。通過(guò)MTT法和流式細(xì)胞術(shù)定量，證實(shí)了NO對(duì)單核細(xì)胞的保護(hù)作用(圖5C-F)。然而，CP給藥可以逆轉(zhuǎn)SNP對(duì)單核細(xì)胞的保護(hù)作用。添加唑來(lái)膦酸鈉后，單核細(xì)胞iNOS活性明顯降低(圖5G)。作者進(jìn)一步研究了唑來(lái)膦酸鈉誘導(dǎo)小鼠單核細(xì)胞毒性的分子機(jī)制和一氧化氮的保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)RIPK3的磷酸化水平顯著上調(diào)，相關(guān)的下游信號(hào)效應(yīng)物MLKL的磷酸化也顯著上調(diào)(圖5H)。這些結(jié)果表明，唑來(lái)膦酸鈉刺激后24 h，凋亡通路被激活。此外，NO預(yù)處理可以降低壞死中毒效應(yīng)物的水平，包括RIPK3磷酸化和MLKL磷酸化，抑制單核細(xì)胞壞死。而用CP阻斷單核細(xì)胞NO可抑制SNP引起的改變。NO處理通過(guò)抑制RIPK3磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)下游代謝，最終減輕唑來(lái)膦酸鈉誘導(dǎo)的單核細(xì)胞壞死。

總結(jié)

該研究揭示了免疫反應(yīng)代謝組學(xué)特征的一種新的調(diào)節(jié)機(jī)制。膳食硝酸鹽可以通過(guò)在體內(nèi)產(chǎn)生NO來(lái)調(diào)節(jié)唑來(lái)膦酸鈉刺激的單核細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，促進(jìn)損傷后骨重塑。該研究有助于了解唑來(lái)膦酸鈉的免疫發(fā)病機(jī)制，并提供了膳食硝酸鹽在臨床預(yù)防BRONJ的可行性。