關(guān)于冠狀病毒復(fù)制—轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)藥物設(shè)計(jì)的思考

——Structures and functions of coronavirus?replication?-transcription complexes?and their relevance for SARS- CoV-2drug design閱讀心得

寫在前面

? ? 怎么說呢，這個(gè)系列就是把自己的homework拿出來曬一曬，也就是圖一樂丟人現(xiàn)眼一下，因?yàn)楸救四芰椭R(shí)范圍有限，難免會(huì)有錯(cuò)誤，請諒解一下，也就是僅供參考。引文都有標(biāo)注，如果有侵權(quán)的可以聯(lián)系我。歡迎各位大佬多交流，提問題、指錯(cuò)誤。要是能關(guān)注一波那就更好了 ！?

1 冠狀病毒

冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus），具囊膜（envelope），基因組為線性單股正鏈的RNA（ssRNA＋）病毒，直徑約80-120nm，基因組大小為27-32kb,5'端有帽子，3'端有Poy(A）尾巴。[1]

自2019年COVID-十九大流行以來，針對冠狀病毒的藥物研究與日俱增。病毒在細(xì)胞內(nèi)的生活歷程大致便是復(fù)制基因組并表達(dá)其蛋白質(zhì)以制造新的病毒粒子，而冠狀病毒相較于其他病毒更依賴于大量RNA復(fù)制酶來復(fù)制其龐大的基因組，所以其復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程的中心酶—RNA 依賴RNA 聚合酶（RdRP）便是明顯的抗病毒藥物靶點(diǎn)。[2]

1.1冠狀病毒的生活史

冠狀病毒的生活史大致可分為四個(gè)階段（如Fig1所示）

（1）進(jìn)入宿主細(xì)胞：SARS的刺突糖蛋白與宿主細(xì)胞表面蛋白受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)合，通過被宿主細(xì)胞胞吞并膜融合的形成進(jìn)入宿主細(xì)胞，基因組RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，其編碼至少13個(gè)可識(shí)別的開放閱讀框（ORF)，在基因組5 '端到3 '端上線性排列，gRNA的編碼部分兩側(cè)各有一個(gè)非編碼區(qū)（如Fig2所示）。

（2）RNA復(fù)制的準(zhǔn)備：SARS- CoV-2 gRNA在細(xì)胞質(zhì)中首先招募宿主核糖體，并率先進(jìn)行復(fù)制酶ORF1a和ORF1b的翻譯過程，由此得到氨基末端共線復(fù)制酶多蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab經(jīng)過多種蛋白酶水解后，釋放出16個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural，nsp）。pp1a生成nsp1到nsp11，而pp1ab則被切割成nsp1到nsp10, nsp12到nsp16?？焖籴尫诺膎sp1介導(dǎo)宿主mRNAs翻譯的關(guān)閉，而其他非結(jié)構(gòu)蛋白形成蛋白質(zhì)復(fù)合物（尚未明確確定），參與病毒RNA合成，被稱為復(fù)制－轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（replication–transcription complexes，RTC)，其中nsp12含有RdRp結(jié)構(gòu)域，在nsp7和nsp8的協(xié)助下催化RNA合成，共同形成全酶RdRp (holo- RdRp)，其他RTC亞基在RTC中起輔助作用，調(diào)節(jié)宿主的先天免疫反應(yīng)或?qū)⒓?xì)胞膜改造成稱為“復(fù)制細(xì)胞器”的特殊雙膜結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)病毒RNA合成。

（3）RNA的復(fù)制：通過RTC的作用，生成全長的反義負(fù)鏈模板，從負(fù)鏈亞基因組模板中合成亞基因組mRNAs，亞基因組mRNAs的翻譯會(huì)產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白

（4）病毒粒子的組裝：病毒粒子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝，并通過溶酶體運(yùn)送到細(xì)胞外。[2-3]

1.2冠狀病毒的相關(guān)復(fù)制—轉(zhuǎn)錄復(fù)合物

冠狀病毒的復(fù)制——轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（RTC）由其核心的RdRp 全酶（holo-RdRp，包括nsp7/nsp82/nsp12）及其他輔助nsp蛋白構(gòu)成并共同發(fā)揮作用（如Fig 3），合成所有病毒RNA分子。RdRp是瑞德西韋等抗病毒藥物的靶點(diǎn)。除了在病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮核心作用外，RdRp還包含一個(gè)N端套式病毒RdRp相關(guān)的核苷酸轉(zhuǎn)移酶（nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase, NiRAN）結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域功能未知，但具有對病毒傳播必不可少的酶活性。

?holo-RdRp被認(rèn)為在病毒生命周期中與一些輔助因子進(jìn)行協(xié)調(diào)。這些輔助因子之一是nsp13，它是一種以NTP依賴的方式以5'->3'極性解開DNA或RNA的超家族1B（SF1B）螺旋酶。這種螺旋酶對于套式病毒馬動(dòng)脈炎病毒（equine arteritis virus, EAV）和β冠狀病毒小鼠肝炎病毒的復(fù)制是必不可少的，并被推測在所有套式病毒中都是必不可少的。這種螺旋酶被認(rèn)為在病毒生命周期的許多方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。[2][4]

2 冠狀病毒的藥物設(shè)計(jì)

盡管針對SARS- CoV-2的疫苗已經(jīng)顯示出顯著的療效，但COVID-19仍在繼續(xù)傳播并影響全球社區(qū)。為了避免新冠病毒的不斷演化導(dǎo)致疫苗效率降低等負(fù)面影響，尋找抵抗SARS- CoV-2及相關(guān)病毒的藥物仍然是研究界的優(yōu)先事項(xiàng)。而目前主要有三種研發(fā)新藥的策略。

第一種策略是測試已有的廣譜抗病毒藥物。過去用于治療冠狀病毒肺炎的干擾素、利巴韋林、以及親環(huán)蛋白抑制劑（cyclophilin inhibitors）。這些療法的優(yōu)點(diǎn)在于早已獲批上市，治療不同的病毒感染，因此其在人體內(nèi)的代謝特征，使用的劑量，潛在的療效和副作用都很明確。但缺點(diǎn)在于這些療法過于“廣譜”，不能針對性地治療冠狀病毒。

第二種策略是利用已有的分子庫和數(shù)據(jù)庫，篩選可能對冠狀病毒有治療效果的分子。這種策略能夠在很短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高通量的篩選，也能夠測試許多原本不會(huì)被考慮到的藥物分子，但盡管許多藥物在體外展現(xiàn)出了良好的抗冠狀病毒活性，卻往往不具有人體內(nèi)應(yīng)用的價(jià)值。一方面是因?yàn)榭赡軙?huì)帶來免疫力抑制的副作用，另一方面則是因?yàn)樗幬锲鹦璧臐舛?，往往?huì)超過血清藥物濃度的上限。

第三種策略最為直接，根據(jù)不同冠狀病毒的基因組信息和病理特點(diǎn)，有從頭開發(fā)新藥。例如最近美國批準(zhǔn)上市的核苷酸類似物remdesivir和molnupiravir就可以靶向RdRp，Remdesivir在冠狀病毒RNA的復(fù)制過程中會(huì)模擬ATP進(jìn)入復(fù)制機(jī)器RdRp中，卡在RdRp和模板RNA之間，導(dǎo)致RNA的合成終止，達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的。而Molnupiravir的結(jié)構(gòu)比較靈活，在新冠病毒的合成過程中，它能模擬CTP和UTP插入到新冠病毒的RNA中，導(dǎo)致“致命誘變”，實(shí)現(xiàn)抑制新冠病毒的復(fù)制增殖的目的。理論上說，這些療法的抗冠狀病毒效果會(huì)更勝一籌，但它需要驗(yàn)證不同藥物在人體中的代謝情況和副作用，也需要依次開展動(dòng)物和人類的臨床試驗(yàn)，觀察是否安全有效，從研發(fā)到上市的時(shí)間跨度太長。[2][6][7]

3 思考與展望

??在全球疫情大流行的當(dāng)下，針對SARS-COV-2的研究刻不容緩，哪怕如今毒株的嚴(yán)重性與致死性已經(jīng)有了明顯的下降，我們也無法忽視憑借RNA病毒極快的變異速率，會(huì)在什么時(shí)候?qū)е轮虏⌒耘c致死性再度回升，導(dǎo)致疫苗的預(yù)防效果下降，只有徹底地解析了解病毒生活史的方方面面，了解其蛋白組的詳細(xì)信息，摸清病毒的保守部分，我們才能更好地針對性研發(fā)出可以長期使用藥物。

但新型藥物藥研發(fā)存在的種種瓶頸仍然困擾著我們，例如缺乏合適的動(dòng)物模型、病毒的突變性和多樣性使得部分新藥物失靈，臨床試驗(yàn)缺乏患者等。這些問題需要科學(xué)家、政府以及每一位普通人的努力，這場席卷全球的瘟疫才會(huì)逐漸平息。

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參考文獻(xiàn)：

[1]?黃保洋，張歡，曹玟瑾，李甜，王炳輝.冠狀病毒特征與進(jìn)化優(yōu)勢[J/OL].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)1-7[2022-12-14].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2237.R.20221114.0939.022.html

[2]?Malone B, Urakova N, Snijder EJ, Campbell EA. Structures and functions of coronavirus replication-transcription complexes and their relevance for SARS-CoV-2 drug design. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022 Jan;23(1):21-39. doi: 10.1038/s41580-021-00432-z. Epub 2021 Nov 25. PMID: 34824452; PMCID: PMC8613731.

[3]?https://zhuanlan.zhihu.com/p/107320312

[4]?Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, Maruthi K, Eng ET, Vatandaslar H, Chait BT, Kapoor TM, Darst SA, Campbell EA. Structural Basis for Helicase-Polymerase Coupling in the SARS-CoV-2 Replication-Transcription Complex. Cell. 2020 Sep 17;182(6):1560-1573.e13. doi: 10.1016/j.cell.2020.07.033. Epub 2020 Jul 28. PMID: 32783916; PMCID: PMC7386476.

[5]?Yan L, Ge J, Zheng L, Zhang Y, Gao Y, Wang T, Huang Y, Yang Y, Gao S, Li M, Liu Z, Wang H, Li Y, Chen Y, Guddat LW, Wang Q, Rao Z, Lou Z. Cryo-EM Structure of an Extended SARS-CoV-2 Replication and Transcription Complex Reveals an Intermediate State in Cap Synthesis. Cell. 2021 Jan 7;184(1):184-193.e10. doi: 10.1016/j.cell.2020.11.016. Epub 2020 Nov 14. PMID: 33232691; PMCID: PMC7666536.

[6]?Zumla A, Chan JF, Azhar EI, Hui DS, Yuen KY. Coronaviruses - drug discovery and therapeutic options. Nat Rev Drug Discov. 2016 May;15(5):327-47. doi: 10.1038/nrd.2015.37. Epub 2016 Feb 12. PMID: 26868298; PMCID: PMC7097181.

[7]?https://new.qq.com/rain/a/20200126A03NGF00