?????? 腺相關病毒（AAV）作為一種重要的基因傳遞和表達工具，近年來在科學研究和基因治療領域得到了廣泛的應用。AAV獨特的性質使其成為理想的基因載體，包括高度特異的感染能力、長期穩(wěn)定的表達和較低的免疫原性。然而，大家在實際的科研應用過程中可能會存在一些疑慮或使用問題，這里小恒其中一些主要問題進行匯總分析。

1、AAV載體的使用過程中是否會存在生物安全問題？

?????? 目前為止，還未報道有AAV參與任何疾病的發(fā)生。重組AAV載體一般不具備復制能力并且宿主基因組整合率低，分子量小、免疫原性極低，因此安全性高。不僅應用于動物研究，即使是用于臨床也是安全性非常高的一種病毒載體，重組AAV載體在基因治療上的臨床應用就是很好的例子。另外，NIH也指出AAV屬于RG1類生物制劑，即低風險的、與人類和動物疾病無關的生物制劑。因此，在AAV的操作中注意常規(guī)的安全防護和消毒即可。

2、AAV的血清型是指什么？

?????? 首先需要明確的一點是目前幾乎所有重組AAV病毒載體的核心骨架都是來源于AAV2亞型，即由其遺傳物質Rep基因決定。AAV血清型則是指包裹遺傳物質的蛋白質外殼，也就是衣殼蛋白，由Cap基因編碼，這是病毒識別和結合細胞表面受體的關鍵。因此，不同血清型的區(qū)別就在于衣殼蛋白的氨基酸序列和空間結構的差異，進而使得不同血清型對特定組織或細胞具有不同的嗜性，選擇合適AAV血清型是實驗成功的關鍵要素之一。另外，AAV血清型可以直接表示為例如AAV2、AAV5、AAV9等，核心骨架都默認為AAV2亞型，完整的可以表示為例如AAV2/2、AAV2/5、AAV2/9等等。

3、除了特異性AAV血清型外，還經(jīng)?？吹接刑禺愋詥幼?，二者有什么區(qū)別嗎？

?????? AAV血清型是針對病毒感染特性而言的，而特異性啟動子的作用是在于病毒感染后的基因表達層面。通常所說的特異性啟動子是指組織特異性啟動子或器官特異性啟動子，它是來源于只在某些特定組織或器官表達的基因的啟動子，且該啟動子的活性較好，在其特異性表達功能的加持下使得具有特異性血清型的AAV靶向性更強。然而需要清楚的一點是，生物體內細胞表達調控非常復雜，實際應用過程中并非所有特異性啟動子會都嚴格遵循表達特異性，在某種程度上講可以定義為相對特異性，因此預實驗很重要！

4、AAV注射動物后一般多久可以觀察效果？

?????? AAV屬于單鏈DNA病毒，感染細胞后需要在胞內形成雙鏈DNA形式才能進行基因表達，這個過程一般比較漫長，在注射病毒后1-2周才開始表達，但此時的表達量比較低，還不適于取材檢測，通常是建議3-4周后再后續(xù)的檢測。想要快速表達的AAV可以選擇scAAV，即DNA為雙鏈的自互補AAV，它跳過了單鏈AAV的限速步驟，可以在注射后3-5天達到表達高峰，但缺點也很明顯，scAAV的包裝容量相比對單鏈AAV少了一半。

5、AAV用于動物感染時如何提高感染效率？

?????? 排除動物本身狀態(tài)的影響外，單從AAV使用角度看，我們需要依據(jù)感染的目標，然后通過查詢參考文獻和病毒使用說明，去選擇合適的AAV血清型、注射方式、注射位點以及注射量。為降低實驗成本、提高成功率，建議在正式實驗之前先進行預實驗，摸索出最佳實驗條件，更有利于實驗的開展。

6、在動物體內注射AAV后，并未達到理想的效果，或是甚至檢測不到目的基因的過表達或敲低，會有哪些原因呢？

?????? 這一問題涉及的可能性比較多，需要一一排除，綜合考慮各方面影響因素：

（1）病毒問題：外源基因序列大小是否在AAV的包裝容量內，AAV的包裝容量通常不超過4.7kb，在除去啟動子、熒光標簽和蛋白標簽等元件后，實際上外源基因的容量一般在2kb以下。再者，病毒滴度是否符合要求，小恒建議保存半年以上的病毒最好重新測定下滴度再使用。還有在保存方式要得當，避免反復凍融，計劃一周內用完可以放置4℃保存，長期保存需分裝后于-80℃保存。

（2）組織/細胞特異性問題：前面的問題也提到了AAV具有不同組織嗜性的血清型、可以攜帶特異性啟動子、不同組織部位的注射方式可能不同、注射量不同，這些都是AAV感染效率和表達特性的重要影響因素。

（3）檢測時間問題：檢測時間點是否處于AAV表達高峰的時間段，過早或過晚做檢測都有可能達不到理想效果。

（4）目的基因的本底表達水平：構建AAV以調控基因表達前，是否檢測過目標組織或細胞中目的基因的本底表達水平，本底表達較高做過表達、本底表達較低做干擾很可能觀察不到調控效果。

（5）取材方式問題：動物組織或細胞的取材時間、方式、保存條件是否合適，比如選擇石蠟切片還是冰凍切片；如果要具體檢測到某一種細胞，可以通過流式分選等方法把目標細胞從組織中分離出來再做檢測。

（6）檢測方式問題：檢測目的基因的表達水平通常是做qPCR（mRNA水平）和WB（蛋白水平），其中要考慮的一個問題是AAV預計感染的是整個組織還是組織中的某種細胞，后者就要分離出目的細胞后做表達水平的檢測，此外檢測中使用的試劑、引物、抗體的質量也在考慮的范圍內。如果AAV帶有熒光標簽，還可以通過活體成像和組織冰凍切片直接觀察熒光以反映感染效率。建議使用不同方法、不同層面檢測AAV感染效率和目的基因調控效果。

（7）組織細胞自身的調控因素影響：事實上，絕大多數(shù)情況下mRNA和蛋白表達水平之間并不是一種線性的關系，這個過程中涉及翻譯調控、蛋白修飾、蛋白半衰期等因素影響。另外，還可能出現(xiàn)代償性表達升高或下調的趨勢導致檢測不到蛋白的顯著變化。

（8）其他問題：實驗動物的選擇和健康狀態(tài)是否滿足需求、實驗操作技術是否熟練以及儀器的正確使用等也是影響實驗成敗的關鍵。

7、AAV感染動物后，為什么會觀察不到熒光或熒光微弱？

?????? 這里除了要關注問題6的因素外，還要考慮熒光蛋白的特性，例如熒光蛋白的亮度、穩(wěn)定性等。制作組織切片過程中使用的有機溶劑有可能會改變熒光蛋白的結構，導致熒光淬滅；GFP在酸性環(huán)境中易淬滅。

8、石蠟組織切片能直接觀察熒光來看感染效率嗎？

不可以。雖然石蠟切片能較好地保存完整的組織結構，但制片過程中需要使用酒精、二甲苯等有機溶劑，這會導致熒光蛋白構象發(fā)生改變，而無法被激發(fā)出熒光?？梢酝ㄟ^對熒光蛋白進行免疫熒光染色再觀察。

9、需要觀察動物活體成像，AAV選擇帶熒光蛋白基因好還是熒光素酶基因好？

?????? 就熒光蛋白和熒光素酶比較而言，熒光素酶更適合用于活體成像觀察，它的熒光穿透力更強，由其底物催化發(fā)光（即生物發(fā)光），因此觀察到的背景低、效果好，且底物對動物的生理狀態(tài)幾乎沒有影響；而熒光蛋白需要特定波長的激發(fā)光激發(fā)出熒光，有趣的是動物體的毛發(fā)等組織也會因此表現(xiàn)出熒光，導致出現(xiàn)背景影響觀察；通過對觀測部位剃毛，可減少背景。

?????? 另一方面，根據(jù)后續(xù)實驗需求選擇，如果需要切片或分離細胞觀察熒光，則選熒光蛋白。其中綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白都是比較常用的，為兼顧活體成像我們更推薦使用紅色熒光蛋白，紅色熒光或近紅外熒光的波長較長，熒光穿透更好，更利于活體成像觀察。

?????? 還有一點關于檢測方面的，熒光素酶屬于底物催化的生物發(fā)光，做活體成像檢測時無需設置激發(fā)光，如果觀察過程中出現(xiàn)背景熒光可考慮下是不是這里設置有誤。

10、AAV可以實現(xiàn)體內的基因調控，那是否意味著也可以做基因敲除呢？

答案是可以的，但是有風險、有條件的。通過AAV利用Crispr/Cas9技術做在體敲除，理論上可以實現(xiàn)但實際上很難得到想要的結果，一方面是本身編輯效率低，另一方面是體內無法做篩選，最終得到的可能只是敲低的效果甚至是沒有變化，因此風險很高。另一種方法是運用cre-loxp系統(tǒng)進行的敲除，前提是必須要有flox動物，再配合AAV-cre使用即可實現(xiàn)靶基因的敲除。

11、需要對動物進行造模，什么時間注射AAV合適？

?????? AAV的表達高峰在注射后3-4周，然后結合動物造模的時間、注射AAV的目的來推算注射時機。比如AAV調控基因表達進而起治療作用，則一般要把控AAV的表達高峰期與造模過程同步；如果是起預防作用，那么可能就要在造模前或造模早期使AAV處于表達高峰期。當然，還是需要具體問題具體分析，根據(jù)模型特點來判斷。需要注意的是，AAV的表達高峰期能維持多久是沒有一個具體時間范圍的；如果造模時間較長，可以在首次注射后1-2個月補打一次來維持長時間的高表達狀態(tài)。

12、AAV能不能用于體外細胞感染呢？

?????? 一般情況下，我們不推薦使用AAV直接體外感染細胞。AAV表達時間長，而通常體外細胞系的增殖速度較快，限制了AAV的表達能力。如果一定要用于體外細胞感染，最好使用特異性血清型，且感染過程需要用很高的MOI（104~105）進行感染，具體需要預實驗摸索。?????

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