又是一篇孟德爾隨機(jī)化研究！小云毫不猶豫的說，現(xiàn)在見刊出版的每一篇孟德爾隨機(jī)化文章，都是值得學(xué)習(xí)的！因?yàn)榍捌诰淼奶偪?，套路過于成熟，而現(xiàn)在還能搞出高分文章出來，作者都是做了很多的創(chuàng)新的，這些創(chuàng)新思路和研究方法太值得學(xué)習(xí)了，因?yàn)槟呐虏皇亲鯩R研究，這些創(chuàng)新思路和研究手段在其他生信研究中同樣可以應(yīng)用！所以可千萬不能錯(cuò)過喲！ 話不多說，直接上文！今天小云帶來的這項(xiàng)MR研究，選題上針對(duì)的是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA），關(guān)注的是藥物治療方面的研究。這項(xiàng)研究的優(yōu)點(diǎn)一是第一次使用MR來識(shí)別RA藥物靶點(diǎn)的研究，利用了迄今為止最大的公開可訪問的RA風(fēng)險(xiǎn)GWAS的數(shù)據(jù)，并使用了MR復(fù)制研究，大大減少了假陽性的可能性；二是富集分析闡明了這項(xiàng)基因的功能特性以及這項(xiàng)藥物靶基因通過PPI的調(diào)控關(guān)系，為旁路開發(fā)RA藥物提供了潛在的可能性；藥物預(yù)測說明了這些基因的藥用潛力，分子對(duì)接的高結(jié)合活性表明這些基因作為藥物靶點(diǎn)的強(qiáng)大潛力。 總之，在這項(xiàng)大規(guī)模藥物靶標(biāo)探索中，作者整合了MR研究、藥物預(yù)測、基因共定位分析、PheWAS分析、基因富集分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等一系列分析手段。生信手段齊出馬，簡直是生信研究人的福音啊，這樣的學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)可不能白白錯(cuò)過，小伙伴們快和小云一起來學(xué)習(xí)吧！

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題目：從遺傳學(xué)角度確定治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在藥物靶點(diǎn)：孟德爾隨機(jī)研究

雜志：

Journal of Translational Medicine

影響因子：IF=?7.4001

發(fā)表時(shí)間：2023年9月11日

研究背景

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以滑膜炎和軟骨破壞為特征的慢性炎癥性免疫介導(dǎo)疾病，主要影響關(guān)節(jié)的滑膜、腱鞘和滑囊等，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹、畸形等和功能障礙。RA無法治愈，患者需長期服用藥物以減輕癥狀，這些藥物通常被歸類為緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物、糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥物和生物藥物。但仍然有很大一部分患者被視為“難治”類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。將遺傳學(xué)納入藥物開發(fā)可能是增強(qiáng)這一過程的最有效策略之一，因?yàn)檫z傳支持的療法更有可能在臨床試驗(yàn)中取得成功。因此，這項(xiàng)研究利用MR模仿隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來預(yù)測藥物療效，與基因表達(dá)變化相關(guān)的SNP（表達(dá)定量性狀位點(diǎn)，eQTL）可能與長期暴露于針對(duì)編碼蛋白的藥物相當(dāng)，利用RA的GWAS與遺傳變異(SNP)之間的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，探討治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在藥物靶點(diǎn)。

數(shù)據(jù)來源

MR分析的暴露（Exposure）數(shù)據(jù)：eQTL數(shù)據(jù)從eQTLGen Consortium (https://eqtlg en.org/) 獲得。這項(xiàng)研究考慮到eQTL更接近藥物開發(fā)研究中感興趣的基因，故使用的eQTL僅限于起點(diǎn)上游5kb或終點(diǎn)下游5kb的SNP，最終獲得了2554個(gè)可成藥基因的eQTL。 MR分析的結(jié)局（Outcome）數(shù)據(jù)：RA發(fā)現(xiàn)隊(duì)列的GWAS數(shù)據(jù)是從之前的一項(xiàng)大型多種族研究中獲得（包括37個(gè)隊(duì)列的35871例RA病例和240149例對(duì)照）。為與暴露數(shù)據(jù)保持一致，選擇了來自歐洲家系樣本（22350例病例和74823例對(duì)照）的GWAS數(shù)據(jù)作為結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)。復(fù)制研究中8279例病例和261098例對(duì)照的復(fù)制隊(duì)列的GWAS數(shù)據(jù)來自FinnGen Release 8 (https://www.finng en.fi/en)。

研究思路

作者首先利用MR方法和GWAS研究數(shù)據(jù)確定RA的新治療靶點(diǎn)，結(jié)合cis-eQTL和RA風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)建立暴露和結(jié)果之間的因果關(guān)系；然后通過藥物預(yù)測和分子對(duì)接研究驗(yàn)證了七個(gè)潛在RA藥物靶點(diǎn)的藥理活性；再進(jìn)行基因共定位分析確認(rèn)潛在治療靶點(diǎn)和RA風(fēng)險(xiǎn)之間的共同驅(qū)動(dòng)因素；再利用PheWAS分析探討潛在治療靶點(diǎn)與其他特征之間的關(guān)聯(lián)；最后，基因富集分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建揭示潛在治療靶點(diǎn)的功能特征和生物學(xué)相關(guān)性。

圖1?研究設(shè)計(jì)及流程

主要結(jié)果

1. 發(fā)現(xiàn)階段中32個(gè)基因與RA風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)

目前針對(duì)RA性狀最大規(guī)模的GWAS是2022年的一項(xiàng)大型多種族研究，包含22350例歐洲血統(tǒng)病例和74823例對(duì)照。如圖所示。如圖2、3所示，在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，32個(gè)基因的表達(dá)與RA風(fēng)險(xiǎn)存在因果關(guān)系（p<1.96E?5=0.05/2554，對(duì)2554個(gè)藥物靶標(biāo)進(jìn)行Bonferroni校正）。然而，進(jìn)行敏感性分析時(shí)，BRSK1基因在三種方法中的效應(yīng)值方向不一致，CD226和MMEL1基因未通過水平多效性檢驗(yàn)（P<0.05），因此這三個(gè)基因被排除在后續(xù)分析之外。異質(zhì)性測試的結(jié)果表明ITPR3、HLA-DPA1、C5、MMEL1和CTLA4的SNP之間存在異質(zhì)性。

圖3?森林圖顯示32個(gè)重要基因在發(fā)現(xiàn)階段的發(fā)現(xiàn)

2. 復(fù)制期12個(gè)基因在獨(dú)立的RA隊(duì)列中仍然很重要

在復(fù)制階段，使用了芬蘭FinnGen數(shù)據(jù)庫中的GWAS數(shù)據(jù)，包含8279例歐洲血統(tǒng)病例和261098例對(duì)照。MR分析的執(zhí)行方式與發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中的相同。使用Wald比率或IVW方法，12個(gè)基因的遺傳預(yù)測表達(dá)被復(fù)制為與RA風(fēng)險(xiǎn)存在因果關(guān)系，如圖4所示（Bonferroni校正后顯著，P<0.0017=0.05/29）。由于三種方法的效應(yīng)值方向不一致，CTLA4基因被排除在后續(xù)分析之外。水平多效性測試顯示任何基因都沒有顯著的多效性。在異質(zhì)性測試中，HLA-DRB1、ITPR3、CTLA4、FCGR2B、CCR6和HLA-DPA1基因顯示出SNP間異質(zhì)性。此外，由于發(fā)現(xiàn)階段和復(fù)制階段之間的效果估計(jì)方向不一致，HLCS基因被排除在后續(xù)分析之外。

圖4?森林圖顯示12個(gè)重要基因復(fù)制階段的發(fā)現(xiàn)

3.?共定位分析

先前的研究表明，顯著的MR結(jié)果可能來自SNP處于緊密連鎖不平衡狀態(tài)的位點(diǎn)，并且其中SNP暴露和SNP結(jié)果關(guān)聯(lián)來自兩個(gè)不同的因果SNP，因此可能導(dǎo)致推斷的假陽性結(jié)果。當(dāng)SNP與暴露和結(jié)果明顯相關(guān)時(shí)，共定位分析可用于探索暴露和結(jié)果是否具有相同的因果SNP。有證據(jù)表明，經(jīng)過MR和共定位測試的蛋白質(zhì)更有可能成為藥物靶點(diǎn)，并且更有可能獲得批準(zhǔn)。因此，作者決定使用發(fā)現(xiàn)階段數(shù)據(jù)對(duì)之前分析中提出的11個(gè)基因進(jìn)行共定位。如表1所示，11種蛋白中的7種（CCR6、HLA-DPA1、HLA-DRB1、IFNGR2、C5、ATP2A1和FEN1）顯示出與RA共定位的有力證據(jù)（PP.H4>0.8），并且可以作為候選藥物靶點(diǎn)基因。

表1?11個(gè)基因的eQTL與RA相關(guān)SNP的共定位結(jié)果

4.?PheWAS

為了進(jìn)一步評(píng)估所確定的7個(gè)潛在藥物靶基因是否會(huì)對(duì)其他性狀產(chǎn)生有益或有害的影響，以及是否存在MR-Egger攔截測試未捕獲的潛在多效性，作者使用了17361個(gè)二分表型和1419個(gè)定量表型。阿斯利康PheWAS門戶數(shù)據(jù)庫在基因水平上執(zhí)行PheWAS。PheWAS結(jié)果可以解釋為基因決定的蛋白質(zhì)表達(dá)與特定疾病或性狀的關(guān)聯(lián)。如表2所示，除ATP2A1外，六個(gè)藥物靶標(biāo)均未與基因水平的其他性狀顯著相關(guān)（基因組關(guān)聯(lián)P<5E?8），這表明作用于這些靶標(biāo)的藥物的潛在副作用和這些基因中水平多效性的存在可能很小，進(jìn)一步表明本研究結(jié)果的可靠性。相反，ATP2A1與握力呈正相關(guān)，與手臂阻抗呈負(fù)相關(guān)，表明作用于ATP2A1基因的RA藥物可能會(huì)影響這兩個(gè)性狀，并且ATP2A1基因的MR分析可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生多效性影響。

表2?使用阿斯利康PheWAS門戶發(fā)現(xiàn)與APT2A1顯著相關(guān)的特征

5. 富集分析

GO富集分析通常用于顯示基因和術(shù)語之間的相互作用，而KEGG富集分析可以說明基因和功能通路之間的關(guān)系。如圖5所示，BP類別中最重要的通路均與干擾素-γ相關(guān)（干擾素-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路、對(duì)干擾素-γ的細(xì)胞反應(yīng)、對(duì)干擾素-γ的反應(yīng)）。在CC類中，藥物靶基因同樣富集免疫和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)成分（MHC II類蛋白復(fù)合物、MHC蛋白復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔側(cè)的整合成分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的腔側(cè)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的腔側(cè)）。此外，就MF而言，這些基因還涉及與免疫密切相關(guān)的功能（免疫受體活性、MHCII類受體活性、肽抗原結(jié)合、細(xì)胞因子受體活性和抗原結(jié)合）。如圖6所示，KEGG富集分析的前3條通路分別是炎癥性腸病（IBD）、利什曼病、Th1和Th2細(xì)胞分化，其中IBD是一種自身免疫性疾病。IBD是一種自身免疫性疾病，利什曼病是一種由寄生蟲感染引起的疾病，這三者都與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

6.?PPI網(wǎng)絡(luò)

將七個(gè)藥物靶基因加載到STRING（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建，并將所得文件導(dǎo)入Cytoscape中進(jìn)行可視化。圖7描繪了50個(gè)節(jié)點(diǎn)、375個(gè)邊的PPI網(wǎng)絡(luò)中七個(gè)藥物靶標(biāo)與其他蛋白質(zhì)的相互作用。對(duì)于使用GeneMANIA（https://genem ania.org/）構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)，除了7個(gè)藥物靶點(diǎn)之外，該網(wǎng)絡(luò)還包括另外20個(gè)潛在相互作用的基因，總共490個(gè)相互作用鏈接（圖8）。這些聯(lián)系包括共表達(dá)（84.47%）、共同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（9.90%）和物理相互作用（5.63%）。網(wǎng)絡(luò)的功能分析描述了藥物靶點(diǎn)和相關(guān)基因的作用及其功能。網(wǎng)絡(luò)功能分析結(jié)果與之前的富集分析結(jié)果相似，均顯示出較強(qiáng)的免疫功能相關(guān)性，與RA的自身免疫性疾病本質(zhì)一致。

7.?候選藥物預(yù)測

作者使用DSigDB數(shù)據(jù)庫來預(yù)測潛在有效的干預(yù)藥物。根據(jù)調(diào)整后的p值，顯示了前10種潛在化合物（表3）。結(jié)果顯示，大黃酸(Rhein TTD 00010611/CTD00001002)和酪氨酸磷酸化抑制劑(Tyrphostin AG 538 TTD 00011608)是兩種最重要的藥物，與FEN1和CCR6相關(guān)。相比之下，槲皮素(quercetin CTD 00006679)和砷(ARSENIC CTD 00005442)與大多數(shù)基因相互作用。

表3?使用DSigDB預(yù)測候選藥物

7.?分子對(duì)接

為評(píng)估候選藥物與其靶點(diǎn)的親和力，并由此了解藥物靶點(diǎn)的成藥性，作者進(jìn)行了分子對(duì)接。使用Autodock Vina v.1.2.2獲得前五種候選藥物與相應(yīng)基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)和相互作用，并生成每次相互作用的結(jié)合能，總共產(chǎn)生七種蛋白質(zhì)的有效對(duì)接結(jié)果與藥物（表4和圖9）。每種候選藥物通過可見的氫鍵和強(qiáng)靜電相互作用與其蛋白質(zhì)靶標(biāo)連接。此外，每個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合口袋都被四種候選藥物成功占據(jù)。C5和槲皮素表現(xiàn)出最低的結(jié)合能（?9.364 kcal/mol），表明結(jié)合極其穩(wěn)定。

圖9?可用蛋白質(zhì)小分子的對(duì)接結(jié)果

文章小結(jié)

這項(xiàng)研究有著較為明顯的優(yōu)點(diǎn)。一是第一次使用MR來識(shí)別RA藥物靶點(diǎn)的研究，利用了迄今為止最大的公開可訪問的RA風(fēng)險(xiǎn)GWAS的數(shù)據(jù)，并使用了MR復(fù)制研究，大大減少了假陽性的可能性；二是富集分析闡明了這項(xiàng)基因的功能特性以及這項(xiàng)藥物靶基因通過PPI的調(diào)控關(guān)系，為旁路開發(fā)RA藥物提供了潛在的可能性；最終的藥物預(yù)測說明了這些基因的藥用潛力，分子對(duì)接的高結(jié)合活性表明這些基因作為藥物靶點(diǎn)的強(qiáng)大潛力。這項(xiàng)研究包含從鑒定到藥物結(jié)合特性的完整評(píng)估，以強(qiáng)有力的證據(jù)提出了RA的七個(gè)藥物靶點(diǎn)。所以，現(xiàn)在的MR研究已經(jīng)不在是剛出來時(shí)候的常規(guī)MR研究的，已經(jīng)完全應(yīng)用于臨床研究和藥物治療中了，這也是MR發(fā)文的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，小伙伴們?cè)谧鯩R研究的時(shí)候，也要開始轉(zhuǎn)型了喲，必須要緊隨時(shí)代升級(jí)迭代喲，小云也歡迎隨時(shí)來撩！圖9?可用蛋白質(zhì)小分子的對(duì)接結(jié)果

文章小結(jié)

這項(xiàng)研究有著較為明顯的優(yōu)點(diǎn)。一是第一次使用MR來識(shí)別RA藥物靶點(diǎn)的研究，利用了迄今為止最大的公開可訪問的RA風(fēng)險(xiǎn)GWAS的數(shù)據(jù)，并使用了MR復(fù)制研究，大大減少了假陽性的可能性；二是富集分析闡明了這項(xiàng)基因的功能特性以及這項(xiàng)藥物靶基因通過PPI的調(diào)控關(guān)系，為旁路開發(fā)RA藥物提供了潛在的可能性；最終的藥物預(yù)測說明了這些基因的藥用潛力，分子對(duì)接的高結(jié)合活性表明這些基因作為藥物靶點(diǎn)的強(qiáng)大潛力。這項(xiàng)研究包含從鑒定到藥物結(jié)合特性的完整評(píng)估，以強(qiáng)有力的證據(jù)提出了RA的七個(gè)藥物靶點(diǎn)。所以，現(xiàn)在的MR研究已經(jīng)不在是剛出來時(shí)候的常規(guī)MR研究的，已經(jīng)完全應(yīng)用于臨床研究和藥物治療中了，這也是MR發(fā)文的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，小伙伴們?cè)谧鯩R研究的時(shí)候，也要開始轉(zhuǎn)型了喲，必須要緊隨時(shí)代升級(jí)迭代喲，小云也歡迎隨時(shí)來撩！