MST案例匯總??

植物生長(zhǎng)會(huì)受到各種復(fù)雜多變的逆境條件脅迫，包括干旱、鹽堿和低溫等。在長(zhǎng)期的系統(tǒng)發(fā)育過程中，植物也逐漸形成適應(yīng)、抵抗和忍耐的抗逆性，植物抗逆性機(jī)制為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，今天小編帶大家來了解一下，微量熱泳動(dòng)（MicroScale Thermophoresis, MST）互作技術(shù)在植物適應(yīng)逆境的機(jī)制研究的應(yīng)用。

01

高溫脅迫_蛋白&蛋白互作

Chen, Si‐Ting, et al. "Identification of core subunits of photosystem II as action sites of HSP 21, which is activated by the GUN 5‐mediated retrograde pathway in Arabidopsis."?The Plant Journal?89.6 (2017): 1106-1118.

前人研究發(fā)現(xiàn)位于葉綠體的熱休克蛋白21（HSP21）能夠保護(hù)光系統(tǒng)II復(fù)合體 (PSII)，使其免受細(xì)胞內(nèi)熱和氧化應(yīng)激，但其作用的分子機(jī)制尚不清楚。

中科院植物生理生態(tài)研究所郭房慶研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激下擬南芥HSP21被GUN5依賴的逆向信號(hào)通路激活，并直接結(jié)合其核心亞基D1和D2蛋白來穩(wěn)定PSII。?組成性表達(dá)HSP21可以恢復(fù)熱脅迫下PSII 的熱敏穩(wěn)定性和gun5突變體的功能缺失，表明HSP21是熱脅迫條件下維持類囊體膜系統(tǒng)完整性的關(guān)鍵伴侶蛋白。研究人員借助MST技術(shù)直接在接近天然狀態(tài)下的裂解液中檢測(cè)了HSP21蛋白與PS II核心亞基D1和D2蛋白之間的親和力。

植物內(nèi)某些蛋白較難純化或者純化后活性受影響，利用MST技術(shù)，可直接在植物裂解液內(nèi)進(jìn)行親和力檢測(cè)，無需純化。在本次實(shí)驗(yàn)中，作者裂解表達(dá)35S::D1-eYFP或35S::D2-eYFP的轉(zhuǎn)基因植物，直接向裂解液中加入梯度稀釋的純化HSP21蛋白，檢測(cè)得到HSP21與D1/D2的親和力Kd分別為0.67μM和1.32μM.

02

低溫脅迫_蛋白&離子

Ding, Yanglin, et al. "CPK28-NLP7 module integrates cold-induced Ca2+ signal and transcriptional reprogramming in Arabidopsis."?Science Advances?8.26 (2022): eabn7901.

寒冷的環(huán)境中會(huì)觸發(fā)植物細(xì)胞質(zhì)Ca2+的激增，導(dǎo)致植物的轉(zhuǎn)錄重編程。然而，Ca2+信號(hào)是如何被感知和傳遞到下游的低溫信號(hào)通路仍然是未知的。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊淑華課題組研究發(fā)現(xiàn)，鈣依賴性蛋白激酶28 (CPK28)啟動(dòng)了一個(gè)磷酸化級(jí)聯(lián)，從而作用于低溫誘導(dǎo)Ca2+信號(hào)下游的轉(zhuǎn)錄重編程。這項(xiàng)研究闡明了一種先前未知的機(jī)制，揭示了植物從質(zhì)膜到細(xì)胞核的快速感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)低溫信號(hào)的關(guān)鍵策略。研究中，作者通過MST實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到CPK28可直接與Ca2+結(jié)合。CPK28 EF-hand位點(diǎn)突變蛋白CPK28EFm與Ca2+親和力降低了6倍，證明了EF-hand對(duì)結(jié)合Ca2+非常重要。

03

淹水脅迫_蛋白&離子

Lehmann, Julian, et al. "Acidosis-induced activation of anion channel SLAH3 in the flooding-related stress response of Arabidopsis."?Current Biology?31.16 (2021): 3575-3585.

淹水脅迫導(dǎo)致厭氧菌引發(fā)的胞質(zhì)酸中毒，使植物細(xì)胞感知酸性并通過膜去極化傳遞這種信號(hào)的分子機(jī)制尚不清晰。

德國(guó)維爾茨堡大學(xué)研究表明，擬南芥根中酸中毒誘導(dǎo)的陰離子流出依賴于陰離子通道AtSLAH3，細(xì)胞質(zhì)子濃度的增加使SLAH3從無功能二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詥误w形式，激活了陰離子通道。研究發(fā)現(xiàn)硝酸鹽對(duì)于pH依賴的通道激活至關(guān)重要，并通過MST技術(shù)研究SLAH3與NO3-的結(jié)合。

作者表達(dá)SLAH3-GFP融合蛋白作為熒光信號(hào)源，無需其他標(biāo)記。在pH6.5下檢測(cè)到SLAH3與NO3-相互作用的Kd為120±50 mM。在pH為7.3時(shí)，SLAH3仍與NO3-結(jié)合，但親和力降低了60%，表明SLAH3與陰離子的結(jié)合依賴于pH。

04

干旱脅迫_蛋白和磷脂分子

Yang, Yongqing, et al. "Phosphatidylinositol 3-phosphate regulates SCAB1-mediated F-actin reorganization during stomatal closure in Arabidopsis."The Plant Cell?34.1 (2022): 477-494.

為了應(yīng)對(duì)干旱脅迫，植物關(guān)閉氣孔以減少葉片蒸騰水分的損失。氣孔運(yùn)動(dòng)受信號(hào)分子磷脂酰肌醇三磷酸(PI3P)的調(diào)控。然而，這一過程的分子機(jī)制尚不清楚。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)郭巖研究組研究表明，擬南芥氣孔關(guān)閉過程中，PI3P通過與植物特異性肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白 (SCAB1) 結(jié)合，抑制其寡聚，從而調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉期間保衛(wèi)細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定性和重排。為了檢測(cè)SCAB1蛋白是否可與PI3P結(jié)合，作者進(jìn)行MST實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示二者具有非常強(qiáng)的親和力，解離常數(shù)Kd為4.5±0.09 pmol。為了確定具體結(jié)合位點(diǎn)，作者將PI3P motifs RXLR-dEER進(jìn)行突變，MST結(jié)果顯示，三重突變蛋白不能與PI3P結(jié)合。綜合其他實(shí)驗(yàn)，最終證明，SCAB1的4個(gè)RXLR motifs均具有PI3P結(jié)合能力，且至少需要2個(gè)RXLR才能與PI3P結(jié)合。

05

氧化脅迫_蛋白&離子

Zhou, Xin-Tong, et al. "Ectopic expression of SsPETE2, a plastocyanin from Suaeda salsa, improves plant tolerance to oxidative stress."?Plant science?268 (2018): 1-10.

質(zhì)體藍(lán)素（Plastocyanin）是一種I型含銅蛋白，存在于葉綠體類囊體中，越來越多的證據(jù)表明，植物質(zhì)體藍(lán)素參與了銅的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，但其生理相關(guān)性仍不明確。

中科院微生物所夏桂先和仲乃琴團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來自鹽生堿蓬的質(zhì)體藍(lán)素基因(SsPETE2)具有抗氧化功能，該基因與銅螯合活性有關(guān)。作者通過MST實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SsPETE2可與銅離子結(jié)合，進(jìn)而緩解H2O2的形成。此外，與過表達(dá)AtPETEs的植物相比，表達(dá)SsPETE2的植物對(duì)氧化脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，MST結(jié)果顯示，SsPETE2比AtPETEs具有更強(qiáng)的銅結(jié)合活性。

總 結(jié)??

在抗逆機(jī)制研究中，常常涉及到蛋白和小分子，甚至是與離子的互作。MST技術(shù)在進(jìn)行互作親和力檢測(cè)時(shí)，不依賴于分子量的變化，因此，即使是幾十個(gè)道爾頓的離子和蛋白的親和力也可以輕松勝任。此外，MST親和力檢測(cè)范圍寬（pM-mM），可研究不同強(qiáng)度親和力的互作，是植物抗逆研究中的一件利器。