有關(guān)艾弗里的體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的事實(shí)性錯誤的個人查證
淺談高中生物必修二《遺傳與進(jìn)化》中艾弗里的體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的事實(shí)性錯誤以及借此機(jī)會對艾弗里的體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)
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最近由于疫情在家中不得出門，刷知乎的時候偶然看到了一個標(biāo)題為“高中生物有錯誤的地方，我們?yōu)槭裁催€要學(xué)習(xí)錯誤？”的問題（https://www.zhihu.com/question/356354331），一位高中生物老師列舉了幾點(diǎn)（其實(shí)多數(shù)是由于出版時間的限制，如卒年、組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量等，還有一些是由于現(xiàn)階段我們的知識儲備不夠造成的不嚴(yán)謹(jǐn)，包括必修二對密碼子表的修改等）
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其中有一個是關(guān)于艾弗里實(shí)驗(yàn)的舉例，標(biāo)明了與科學(xué)事實(shí)的不符（新版教材（2019）已修改），讀完之后很讓我吃驚，這么多年來一屆又一屆學(xué)生都學(xué)習(xí)了這個實(shí)驗(yàn)，可書本的描述卻與科學(xué)事實(shí)相違背。（見下圖）
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開始的時候我以為是很明顯的錯誤，但經(jīng)過閱讀之后，根據(jù)文章中的回答，不難看出問題出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)過程上，書本所講述的是：將DNA，蛋白質(zhì)或莢膜多糖分別分離出來，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；但更正后所體現(xiàn)的是“加酶排除后混合”的思想并增添了實(shí)驗(yàn)組的數(shù)量，雖然從整體上來看，這兩種實(shí)驗(yàn)方法都不影響最終的結(jié)論，但是事實(shí)就是事實(shí)，盡管只是一個微乎其微的細(xì)節(jié)，可畢竟還是違背了真正的實(shí)驗(yàn)過程，況且科學(xué)本身就是為了探求事實(shí)，那么在描述的時候也應(yīng)該保持真實(shí)性。
懷著這樣的態(tài)度，我進(jìn)行了對艾弗里先生實(shí)驗(yàn)的資料查閱。通過與圖片中這位老師的私信，我獲得了關(guān)于這個實(shí)驗(yàn)的論文題目。（見下圖）
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題目為“Studies On The Chemical Nature Of The Substance Inducing Transformation Of Pneumococcal Types”(關(guān)于引起肺炎球菌發(fā)生轉(zhuǎn)化的物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究)；
經(jīng)過查找，最終在萬方醫(yī)學(xué)網(wǎng)找到了這篇論文的原文（1943年完成，1944年刊登）（http://med.wanfangdata.com.cn/），文章末尾將會呈現(xiàn)這篇論文。
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關(guān)于格里菲斯的肺炎雙球菌的體內(nèi)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
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討論艾弗里先生的實(shí)驗(yàn)之前，還應(yīng)該說一下格里菲斯（F.Griffith,1877-1941）的實(shí)驗(yàn).
書本中的實(shí)驗(yàn)過程體現(xiàn)在一幅圖中：實(shí)驗(yàn)中有兩種不同類型的肺炎雙球菌，S型（smoot）細(xì)菌的菌體有多糖類的莢膜，形成的菌落表面光滑，可以使人患肺炎或使小鼠患敗血癥；R型（rough）細(xì)菌的菌體沒有多糖類的莢膜，形成的菌落表面粗糙，但并不能引發(fā)上述癥狀。 ???????
實(shí)驗(yàn)中一共有四個小組：通過對第一個小組中小鼠注射R型活細(xì)菌、小鼠不死亡，表現(xiàn)出R型活細(xì)菌無毒性；通過對第二個小組中小鼠注射S型活細(xì)菌、小鼠死亡，表現(xiàn)出S型活細(xì)菌有毒性，接著從小鼠體內(nèi)分離出S型活細(xì)菌；在第三組實(shí)驗(yàn)中，通過將加熱后殺死的S型活細(xì)菌注射到小鼠體內(nèi)、小鼠不死亡，表現(xiàn)出S型細(xì)菌已經(jīng)失去生物學(xué)活性，與第二組形成對比；第四組中，將R型活細(xì)菌與加熱后殺死的S型細(xì)菌混合后注射到小鼠的體內(nèi)、小鼠死亡，并從小鼠體內(nèi)分離出S型的活細(xì)菌，同時分離出來的S型活細(xì)菌的后代也是有毒性的，這表明.無毒性的R型活細(xì)菌與被加熱殺死的S型細(xì)菌混合后轉(zhuǎn)化為有毒性的S型活細(xì)菌，通過后續(xù)的實(shí)驗(yàn)也證明了這種性狀的轉(zhuǎn)化是可以遺傳的——所以格里菲斯得出的一個推論就是，加熱殺死的S型細(xì)菌中必然含有某種促成這一轉(zhuǎn)化的活性物質(zhì)，并稱它為“轉(zhuǎn)化因子”，是這種因子使無毒性的R型活細(xì)菌轉(zhuǎn)化為有毒性的S型活細(xì)菌。但在當(dāng)時并不清楚這種“轉(zhuǎn)化因子”是什么物質(zhì)。
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艾弗里在他的論文中也標(biāo)明了格里菲斯的實(shí)驗(yàn)
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無毒的R型細(xì)菌在文章中稱為II型/RII型/R-II型
有毒的S型細(xì)菌在文章中稱為III型/SIII型/S-III型
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“格里菲斯首先描述了這一現(xiàn)象，他成功地將一種來源于一種特定類型的無毒和非包膜（R）變體轉(zhuǎn)化為一種異種特定類型的有毒和完全包膜（S）細(xì)胞。”
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這一小段說的意思是：一個事實(shí)是R細(xì)菌本身無毒，不能引起敗血癥；另一個事實(shí)就是III型細(xì)胞的熱懸浮液中沒有活的生物體，這些有力的證據(jù)證明了在這些條件下生長的R型細(xì)菌獲得了III型的囊膜結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。
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????同時艾弗里指出，Berry和Dedrick成功將兔纖維瘤病毒轉(zhuǎn)化為傳染性粘液瘤病毒，且采用的方法原則與格里菲斯的實(shí)驗(yàn)相似。
簡單描述了格里菲斯的實(shí)驗(yàn)以及其他的有關(guān)實(shí)驗(yàn)后，作者指出：
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“主要的興趣集中在試圖從粗細(xì)菌提取物中分離出活性成分，并在可能的情況下鑒定其化學(xué)性質(zhì)，或者至少對其進(jìn)行足夠的表征，以便將其放入一組已知的化學(xué)物質(zhì)中。”
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所以我認(rèn)為錯誤可能是從這里開始的。
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艾弗里的體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
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艾弗里在論文中講述了一些實(shí)驗(yàn)前需要滿足轉(zhuǎn)化的一定的培養(yǎng)條件。
1.?營養(yǎng)肉湯，由于知識儲備的限制，我將它簡單地理解為“專門調(diào)配后適合實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基”
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2.血清或血清液
通過其他生物學(xué)家的實(shí)驗(yàn)，作者指出加入血清或血清液是必要的，比如含有R抗體的血清可以誘導(dǎo)R肺炎球菌（無毒）轉(zhuǎn)化到同源S型（有毒）；同時，無論血清中的免疫特性如何，都存在一種能夠破壞有效提取物轉(zhuǎn)化原理的酶，經(jīng)過高溫加熱使這種酶失活后，轉(zhuǎn)化變得有效；然而通過進(jìn)一步分析，某些血清中存在R抗體，并且上述的酶已經(jīng)被滅活，仍無法支持轉(zhuǎn)化，說明血清中還有另一個因素是不可缺少的。可能由于當(dāng)時技術(shù)的限制，作者說明了對于該因子當(dāng)時并不清楚其身份。
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3 ?.R株（R36A）
R36A菌株是通過在含有II型抗肺炎球菌兔血清的肉湯中培養(yǎng)36個連續(xù)傳代的肺炎球菌II型的親本S培養(yǎng)物并分離由此誘導(dǎo)的變異而獲得的，即經(jīng)歷了自發(fā)的分離。但產(chǎn)生的其它R變體中，只有一種R36A易受有效提取物的轉(zhuǎn)化作用影響，所以艾弗里采用了R36A來做實(shí)驗(yàn)
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4.作者在實(shí)驗(yàn)前強(qiáng)調(diào)了必須注意的兩個事實(shí)：
a.?R天然的本質(zhì)可以自發(fā)地分離并產(chǎn)生其他變體，這些變體失去了對轉(zhuǎn)化刺激的反應(yīng)能力
b.?肺炎球菌細(xì)胞含有一種胞內(nèi)酶，當(dāng)釋放時會破壞轉(zhuǎn)化原理的活性。這就說明了盡可能防止與自溶相關(guān)的破壞性變化是非常重要的
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實(shí)驗(yàn)步驟
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1.?對活性物質(zhì)進(jìn)行殺菌。
艾弗里采用酒精對待測材料的活性進(jìn)行滅菌，一個是避免了通過伯克菲爾德過濾器可能發(fā)生的活性物質(zhì)損失，另一個是避免了在滅菌所需的高溫下加熱時可能發(fā)生的活性物質(zhì)損失
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2.?培養(yǎng)
作者在這里選擇加入的是無菌腹水或胸膜液（詳見實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備略解+原文圖片），同時對已知破壞轉(zhuǎn)化原理的酶進(jìn)行了滅活，并開始培養(yǎng)：在滅菌提取物中加入NaOH的鹽水中和至pH=7.2-7.6并連續(xù)稀釋，或在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中同樣稀釋到0.2毫升。每種稀釋液至少加入3--4管到血清培養(yǎng)基中。然后用0.05毫升的R36A在5到8小時的血液培養(yǎng)液對試管進(jìn)行培養(yǎng)。在每根試管中加入4--10倍稀釋的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在37℃下孵育18-24小時
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3.?現(xiàn)象描述/預(yù)計(jì)
這種現(xiàn)象的差異是明顯的，根源就是血清中的抗-R特性導(dǎo)致R細(xì)胞在生長過程中凝集，凝集的細(xì)胞團(tuán)沉淀到試管底部，留下清晰的上清液。作者指出：“當(dāng)轉(zhuǎn)化發(fā)生時，被包裹的S細(xì)胞不受這些抗體的影響，在整個培養(yǎng)基中擴(kuò)散生長。另一方面，在沒有轉(zhuǎn)化的情況下，上清液仍然是透明的，只有R生物的沉淀物生長。這種生長特性的差異使得僅通過檢測就可以初步區(qū)分陽性結(jié)果和陰性結(jié)果。”，同時也說明了轉(zhuǎn)化效果是明顯的，“轉(zhuǎn)化的S細(xì)胞尤其引人注目，后者是大型的，發(fā)亮的，粘液樣的菌落，典型的肺炎球菌III型”
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艾弗里先生在論文中描述的實(shí)驗(yàn)步驟就這樣結(jié)束了，令我大跌眼鏡的是，在實(shí)驗(yàn)步驟中竟然沒有找到可以讓我反駁2004版教材中物質(zhì)分離分別實(shí)驗(yàn)或是支持2019版教材中加酶排除實(shí)驗(yàn)的依據(jù)
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制備方法
以III型肺炎球菌為源材料，獲得其活性原理。
1.?源材料
因?yàn)?/span>純牛肉心臟灌注肉湯中存在著大量的微生物，而將要提取的是純的II型細(xì)菌，所以下面這三段講的是提取方法（包括了對大量的莢膜多糖、蛋白質(zhì)等的洗滌去除）
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“得到的溶液通常是粘性的，乳白色的，有點(diǎn)渾濁。”
2.?莢膜多糖的脫蛋白和去除
在這一點(diǎn)里，作者提到了“加酶破壞”的字樣，下面這段文字在我的理解來看是這樣的：用氯仿法對溶液進(jìn)行脫蛋白，直到溶液變澄清。然后添加能夠水解III型莢膜多糖的細(xì)菌酶的純化制劑，用免疫沉淀物分離制備的III型抗體溶液進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)，這一步用來確定莢膜多糖是否被破壞。最后再次用氯仿法除去添加的蛋白酶和殘留的肺炎球菌蛋白。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟。
那么這一段文字雖然體現(xiàn)出了加酶后將其余物質(zhì)排除、留下進(jìn)行試驗(yàn)、或進(jìn)行化學(xué)分析的物質(zhì)，但依舊無法充分支持2019版教材的加酶排除，很勉強(qiáng)，還需要繼續(xù)往下閱讀
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3.?酒精分餾
這里是用乙醇不斷地將活性物質(zhì)以纖維股的形式分離出來，這是第一批沉淀物；當(dāng)乙醇加到3個體積的時候，殘余部分以絮狀沉淀物的形式出現(xiàn)，這是第二批；進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)后，將得到的纖維材料混合，代表原始粗提取物中活性物質(zhì)的主要部分
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4.?其他條件的影響
講述了如溫度、去氧膽酸等不同條件下對實(shí)驗(yàn)的影響
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純化轉(zhuǎn)化物分析
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論文中的Analysis of Purified Transforming Material這一部分是作者從物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)兩個方面來進(jìn)行分析，由于個人知識儲備的限制，在理解這一部分的時候出現(xiàn)了困難，但仍然獲得一個重點(diǎn)：作者提到對濃縮液中的純化物質(zhì)進(jìn)行了雙縮脲的試驗(yàn)，結(jié)果為陰性，這表明了這種物質(zhì)不是蛋白質(zhì)，進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，源性脫氧核糖核酸純制劑會產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)。
（見下圖）
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化學(xué)分析數(shù)據(jù)表及說明
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?以下是對物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)分析數(shù)據(jù)圖以及說明。同樣因?yàn)橹R儲備的原因，我會將自己所理解的并且在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上說明。
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表1：
a.作者指明，因?yàn)椴荒苓_(dá)到百分百的純化，但根據(jù)最后一欄氮和磷含量的比值說明應(yīng)該不會存在太多蛋白質(zhì)或者其他含有氮和磷的物質(zhì)作為雜質(zhì)，如果有的話這幾組比值的差異會很大的
b.酶的分析，這里再次出現(xiàn)加酶的字樣。
※※※※
在實(shí)驗(yàn)中，各種粗酶和結(jié)晶酶已被測試其破壞有效細(xì)菌提取物生物活性的能力；加入結(jié)晶胰蛋白酶和糜蛋白酶或兩者的組合，用這些酶處理后活性沒有損失；在最佳條件下用結(jié)晶核糖核酸酶長時間處理不會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化活性明顯降低；胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶對轉(zhuǎn)化原理沒有影響，這進(jìn)一步證實(shí)了這種物質(zhì)不是核糖核酸，也不是一種易受胰蛋白酶作用的蛋白質(zhì)；測試了從各種動物器官獲得的血清和酶制劑，其中一些被發(fā)現(xiàn)能夠完全破壞生物活性。
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在上述表1部分的b 點(diǎn)，我認(rèn)為是對2019版教材中實(shí)驗(yàn)步驟改為加酶排除的最有力的支持，作者已經(jīng)說明加入了許多不同種類的酶，如新版教材中標(biāo)明的蛋白酶、RNA酶等，雖然幾頁前的實(shí)驗(yàn)步驟中并未很好的體現(xiàn)，但在這里我認(rèn)為已經(jīng)足以說明真正的實(shí)驗(yàn)步驟是“加酶后混合”，并通過II型細(xì)菌與III型細(xì)菌是否很好轉(zhuǎn)化來初步說明哪些是具有破壞這種轉(zhuǎn)化的酶，從這種酶出發(fā)來分析相應(yīng)的物質(zhì)，并進(jìn)行化學(xué)分析，因?yàn)榭赡軟Q定轉(zhuǎn)化的是很多因素的共同作用，或者某一因素占據(jù)了很大的部分。
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表2
?表2是粗酶制劑對轉(zhuǎn)化原理的滅活作用
??在論述中作者講述了新鮮正常犬和兔血清對轉(zhuǎn)化物質(zhì)活性的影響，由于理解上的困難，只能得到如下的關(guān)鍵信息：
??????由于從肺炎球菌提取物中分離出的高純度轉(zhuǎn)化物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)含有脫氧核糖核酸，所以對相應(yīng)的解聚酶進(jìn)行了活性測試，結(jié)果總結(jié)在表2（下圖），其中通過對磷酸酶，酯酶和核苷解聚酶的活性與它們破壞轉(zhuǎn)化原理的能力進(jìn)行比較，得出的結(jié)論是，無論磷酸酶或酯酶的存在，只有含有能夠解聚真實(shí)的脫氧核糖核酸樣品的酶的制劑被發(fā)現(xiàn)使轉(zhuǎn)化原理失活
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注：本頁圖片中除畫紅線外其他部分為艾弗里先生在實(shí)驗(yàn)中所提到的動物血清實(shí)驗(yàn)
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討論
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在化學(xué)分析之后，艾弗里做了討論，我將基于自己的理解對DISCUSSION這一部分中的一小部分進(jìn)行簡單描述。
作者提出，在所研究的實(shí)例中，高純度且無蛋白質(zhì)的材料（如果不是完全由脫氧核糖核酸組成）能夠刺激肺炎球菌II型的未包被的R變體產(chǎn)生相同的包被多糖，與分離誘導(dǎo)物質(zhì)的細(xì)胞類型的特異性相同。并且引起反應(yīng)的物質(zhì)與反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)在化學(xué)上是不同的；對于誘導(dǎo)物質(zhì)，似乎是一種高度聚合和粘性形式的脫氧核糖核酸鈉，具有獨(dú)特的生物學(xué)特異性；同時，本文提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有力地表明，核酸，至少是脫氧核糖類型的核酸，具有不同的特異性，轉(zhuǎn)化原理的選擇性作用證明了這一點(diǎn)；值得注意的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚地表明，誘導(dǎo)的改變不是隨機(jī)的，而是可預(yù)測的，總是對應(yīng)于從中分離轉(zhuǎn)化物質(zhì)的包膜細(xì)胞的類型特異性。
作者在DISCUSSION的結(jié)尾說：“如果目前對轉(zhuǎn)化原理的化學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果得到證實(shí)，那么核酸必須被視為具有生物特異性，其化學(xué)基礎(chǔ)尚未確定。”
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摘要略
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結(jié)論
作者在論文的結(jié)尾得出了結(jié)論——所提出的證據(jù)支持這樣一種觀點(diǎn)：脫氧核糖型核酸是III型肺炎球菌轉(zhuǎn)化原理的基本單位。
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書中：
書中對于艾弗里的實(shí)驗(yàn)是這樣敘述的：“他們將提純的DNA、蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)分別加入到培養(yǎng)了R型細(xì)菌的培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有加入DNA，R型細(xì)菌才能夠轉(zhuǎn)化為S型細(xì)菌，并且DNA的純度越高，轉(zhuǎn)化就越有效；如果用DNA酶分解從S型活細(xì)菌中提取的DNA，就不能使R型細(xì)菌發(fā)生轉(zhuǎn)化?！?/span>
??
??從下圖中我們不難看出，課本中（2004版）給的第一組實(shí)驗(yàn)是向培養(yǎng)基中加入S型的細(xì)菌的DNA，第二組是加入S型細(xì)菌的蛋白質(zhì)或S型細(xì)菌的莢膜多糖；而從上文我對艾弗里論文簡單的自學(xué)以及淺淺的論述中，所體現(xiàn)的都是用各種生物酶來除去蛋白質(zhì)、RNA、脂質(zhì)等，將留下來的物質(zhì)混合，并檢測轉(zhuǎn)化的活性，其實(shí)留下來的物質(zhì)在今天看來應(yīng)該幾乎都是DNA，而并沒有體現(xiàn)所謂的“分離物質(zhì)分別實(shí)驗(yàn)”的思路。況且第一組是與提取物直接混合。
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總結(jié)：
通過對這篇論文的學(xué)習(xí)，我發(fā)現(xiàn)艾弗里在文中的側(cè)重點(diǎn)是物質(zhì)的提取，提取的目的是進(jìn)行化學(xué)分析，而對于加酶排除的實(shí)驗(yàn)步驟并沒有很具體的說明，的確很難發(fā)現(xiàn)。
這是我第一次寫這類文章，最初是懷著“探索事實(shí)”的態(tài)度來進(jìn)行的，文章中難免會有邏輯的混亂，同時這也是我第一次接觸專業(yè)性這么強(qiáng)的原版論文，在翻譯方面遇到了很多困難，許多內(nèi)容翻譯成中文也無法理解。
可能在別人看來這僅僅是幾個實(shí)驗(yàn)步驟的差異而已，也并沒有影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論，但我覺得這種修正是有必要的，我認(rèn)為科學(xué)就是探索事物的本質(zhì)，研究真相，所以在描述發(fā)現(xiàn)一個真相的時候，也應(yīng)該保持高度的真實(shí)性，畢竟這個真相就是由真相背后真實(shí)的實(shí)驗(yàn)得出的。艾弗里選擇這樣做實(shí)驗(yàn)，可能是這種方法效果更好，也可能是由于時代的限制無法達(dá)到那么高的技術(shù)。
最后，我想引用梭羅先生在《瓦爾登湖》中的一句話來結(jié)束這篇文章：
只有我們醒著的時候,黎明才會到來。
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???????????????????????????????????盧沛言
?????????????????????????????????2020.2.16
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下面是艾弗里先生“關(guān)于引起肺炎球菌發(fā)生轉(zhuǎn)化的物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究”的論文原文。
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