實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞污染常見類型及解決方案
對于養(yǎng)細(xì)胞的人來說，可謂是談「污」色變，每次養(yǎng)細(xì)胞總讓人有種神經(jīng)錯(cuò)亂，一進(jìn)細(xì)胞房就想讓空氣都靜止下來，打開培養(yǎng)皿的一瞬間，連呼吸都變得如此多余。只要有任何異樣，無論是支原體還是雜菌，污染！污染！污染！猶如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的魔咒，讓一切都無限重復(fù)……
今天MDL科研助手盤點(diǎn)了細(xì)胞污染常見類型及解決方案，一篇在手，以后你就能與細(xì)胞愉快的玩耍了！細(xì)胞污染一般分為細(xì)菌污染、真菌污染、支原體感染、黑膠蟲污染。
01
細(xì)菌污染
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細(xì)菌污染最為常見，一旦操作稍有不當(dāng)，就會(huì)引起細(xì)胞污染，細(xì)菌污染后顯微鏡下觀察呈現(xiàn)有黑色細(xì)條沙狀，當(dāng)然，根據(jù)感染的細(xì)菌不同，所呈現(xiàn)的狀態(tài)也不盡相同，有球形、桿狀等，其次，培養(yǎng)液發(fā)黃，變渾濁，可明顯看見培養(yǎng)皿中有細(xì)沙狀的沉淀物，時(shí)不時(shí)還有異樣氣味發(fā)出，如下圖所示：
葡萄球菌污染
解決方案：
在培養(yǎng)基中加入抗生素處理，可以用四環(huán)素，慶大霉素，或者鏈霉素，前兩者的工作濃度是50μg/mL；鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL。但是，細(xì)胞本身也有影響，狀態(tài)大不如從前，所以，防范于未然，正確操作、嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)范，定期清理消毒培養(yǎng)設(shè)施才是關(guān)鍵!
02
真菌污染
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表現(xiàn)：真菌的種類很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不變混濁。
倒置顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長。
有時(shí)通過顯微鏡可能會(huì)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)瓶外壁生長的菌絲，較易誤認(rèn)為污染。發(fā)現(xiàn)瓶外的菌絲后應(yīng)及時(shí)用酒精擦拭干凈。
霉菌污染
解決方案：
趕緊扔掉，不要再想挽救，即使再珍貴。然后徹底消毒滅菌培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液。
03
支原體污染
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支原體直徑約為 0.1-0.3 μm，具有變形能力，可透過常見過濾膜（0.22-0.45 μm），因此常規(guī)的無菌過濾方法不能將其去除，常用的抗生素也對支原體無效。培養(yǎng)條件沒變，又沒有明顯的污染跡象（渾濁、pH等），而細(xì)胞生長突然變慢、狀態(tài)變差、細(xì)胞邊界變得模糊；更換新的培養(yǎng)液，細(xì)胞狀態(tài)沒有恢復(fù)，細(xì)胞形態(tài)異常（拉絲、鋪展）。
注：支原體污染時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)為長得不好，也不死亡，同時(shí)，培養(yǎng)基又是清亮的，時(shí)間長達(dá)一周也沒有什么變化，這時(shí)基本上可以判斷出是支原體污染了。
可見細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)，其形狀各異，與細(xì)胞共同被染成不規(guī)則的點(diǎn)狀物，說明細(xì)胞被支原體污染
解決方案：
1）對于非重要的細(xì)胞，如培養(yǎng)中的細(xì)胞、WCB的細(xì)胞等，將培養(yǎng)物與用過的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細(xì)胞，如來源珍貴或?qū)嶒?yàn)室中細(xì)胞保藏量較小等可以采用以下（2）-（8）的方法。
2）用MRA處理：用支原體清除劑處理細(xì)胞，作用濃度為 25μg/ml，兩周可以清除支原體。
3）用清洗純化法清除支原體污染的方法：細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌，其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限. 如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。
4）藥物輔助加溫處理：先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。
5）使用支原體特異性血清：用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。
6）動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法：把受支原體污染的腫瘤細(xì)胞接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔中，借動(dòng)物免疫系統(tǒng)消滅支原體，而腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)繼續(xù)生長，待一定時(shí)間后，從體內(nèi)取出細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。
7）巨噬細(xì)胞吞噬法：從動(dòng)物腹腔采取巨噬細(xì)胞，為排除其它細(xì)胞成分，可先進(jìn)行純化，然后再加入被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中混合培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，為檢查支原體是否已被消除干凈，可利用支持物培養(yǎng)法驗(yàn)證，取出支持物逐日染色、鏡檢觀察，至支原體已被消除干凈為止。
8）使用支原體清除培養(yǎng)基，每2~3天更換1次新鮮培養(yǎng)液，換液時(shí)用無菌的平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞1~2次；期間如果細(xì)胞密度過大，請保持細(xì)胞密度適當(dāng)（貼壁細(xì)胞可能需要用胰酶消化），并更換新的培養(yǎng)器皿，3天之后，即可見明顯清除效果；處理15天后，可以用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測支原體是否殺滅完全；如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天；為避免細(xì)胞再次受到“支原體”的污染，以后每隔1個(gè)月進(jìn)行支原體的常規(guī)檢測，以保證沒有新的支原體污染。
04
黑膠蟲污染
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“黑膠蟲”是一種常見的細(xì)胞污染物，與細(xì)胞共生，隨細(xì)胞傳代而傳代?！昂谀z蟲”與細(xì)胞競爭性生長，對細(xì)胞生長不利，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前很多細(xì)胞存在被“黑膠蟲”污染的現(xiàn)象，對細(xì)胞培養(yǎng)及其后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成了極大地影響。
“黑膠蟲”污染的細(xì)胞常見的特性有以下幾點(diǎn)：
培養(yǎng)基不渾濁，但在顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞周圍和培養(yǎng)液中有很多“小黑點(diǎn)”， 且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長“小黑點(diǎn)”逐漸增多，更換培養(yǎng)液或洗滌細(xì)胞不能將其去除；
“黑膠蟲”污染的細(xì)胞，營養(yǎng)消耗快，需要頻繁更換培養(yǎng)液；
“黑膠蟲”污染的細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞狀態(tài)差，空泡化嚴(yán)重，甚至還可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變。
解決方案
對于黑膠蟲污染的細(xì)胞，最為快速有效的處理方式就是采用黑膠蟲清除劑對黑膠蟲進(jìn)行清除，同時(shí)確保培養(yǎng)體系中的血清必須為無黑膠蟲和原蟲污染的優(yōu)質(zhì)血清。
