空間代謝組學(xué)研究方法正成為一種越來越重要的手段，以提供深入了解原位組織細胞的異質(zhì)性，以及細胞如何在其微環(huán)境中相互作用和行為做出一定的解釋。由于巨大的結(jié)構(gòu)多樣性、快速的周轉(zhuǎn)率和在有限的樣本量中的低分析物豐度，在單細胞分辨率下分析整個細胞代謝物具有挑戰(zhàn)性。因此，高空間分辨率代謝組學(xué)方法被提出作為一種在單細胞分辨率下測量代謝物和脂質(zhì)的空間分布的方法。同位素示蹤和空間代謝組分析相結(jié)合來作為原位評估代謝動力學(xué)的方法。

2022年9月，萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心課題組在《Nature Metabolism》期刊（IF:19.865）發(fā)表了題為“Analyzing cell-type-specific dynamics of metabolism in kidney repair”的研究成果，研究提出了一種先進的空間分辨率代謝組學(xué)方法，利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像結(jié)合同位素示蹤的空間代謝組學(xué)方法。這種方法允許在一個復(fù)雜的異質(zhì)性組織結(jié)構(gòu)的背景下，繪制中心碳代謝的細胞類型特異性的動態(tài)變化（如腎臟），結(jié)合多路免疫熒光染色，該方法可以檢測目標細胞類型的代謝變化和營養(yǎng)分配，這在雙側(cè)腎缺血-再灌注損傷（bIRI）實驗?zāi)Ｐ椭械玫搅俗C實。

研究思路

研究結(jié)論

1.細胞類型特異性動態(tài)代謝測量和分析

通過使用13種C標記的營養(yǎng)物質(zhì)，可以追蹤13種C同位素與糖酵解和三羧酸（TCA）循環(huán)的主要中間體的時空結(jié)合（圖1a）。使用不同的標記營養(yǎng)物質(zhì)不僅可以可視化隨時間的動態(tài)變化，還可以解決它們對特定代謝途徑的貢獻。為了實現(xiàn)這一點，作者使用了一個組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其中350μm厚的新鮮小鼠腎臟振動組切片（圖1b）孵育2小時。運用空間代謝組學(xué)實驗，將切片染色，隨后使用多路免疫熒光（IF）顯微鏡成像，以進行細胞類型鑒定（圖1c）。為了在1像素內(nèi)沒有批效應(yīng)的情況下顯示所有動態(tài)代謝變化，作者遵循了Stuart等人在Seurat包14中介紹的兩步過程：(1)使用單像素脂質(zhì)譜識別兩個數(shù)據(jù)集之間的錨點；(2)通過k-最近鄰（KNN）分析從標記數(shù)據(jù)集中轉(zhuǎn)移所有測量的13個富c代謝產(chǎn)物的豐度，將13個c標記代謝產(chǎn)物產(chǎn)量計算到對照數(shù)據(jù)集（圖1d）。最后，在計算值生成的偽圖像中可視化了代謝動力學(xué)的原位異質(zhì)性（圖1e）。

圖1 | 細胞類型特異性動態(tài)代謝測量和分析的工作流程

2.小鼠IRI腎臟的脂質(zhì)異質(zhì)性

為了可視化整個腎組織切片的整體代謝異質(zhì)性，作者使用了20×20μm像素分辨率的空間代謝組學(xué)方法，根據(jù)其特定的脂質(zhì)特征，在空間和分子上分辨了所有主要的腎臟結(jié)構(gòu)（圖2a和擴展數(shù)據(jù)圖1）。腎bIRI兩周后，作者發(fā)現(xiàn)了額外的具有獨特的簇（Injured_1、Injured_2、Injured_3和Injured_4）的脂質(zhì)特征，與LTL和e-鈣粘蛋白染色丟失相對應(yīng)（圖2a-c）。然后，作者使用集成的3D UMAP分析生成空間分割圖像，顯示腎臟分子組織學(xué)。這些圖像顯示，在bIRI腎的皮質(zhì)和外髓質(zhì)中均存在持續(xù)的腎小管損傷（圖2d）。與腎皮質(zhì)（PT-S1/PT-S2）相比，外髓質(zhì)外條紋（PT-S3）的PT結(jié)構(gòu)明顯丟失（圖2e)。這些觀察結(jié)果也通過組織病理學(xué)染色得到了證實（圖2f）。

圖2 |?小鼠IRI腎臟的脂質(zhì)異質(zhì)性

3.假腎PT細胞的動態(tài)代謝測量

為了探討腎皮質(zhì)PT和外髓質(zhì)外條紋的代謝異質(zhì)性及其對損傷的反應(yīng)，在空間代謝組學(xué)后，進行IF染色以確定細胞類型（圖3a）。作者可以區(qū)分兩個PT-S1和PT-S2皮質(zhì)段和一個髓質(zhì)PT-S3段(圖3a-c）。作者將PT-S1和PT-S2結(jié)合起來進行后續(xù)分析，因為作者不能根據(jù)LTL染色或它們的位置對它們進行注釋。同位素分析表明，與PT-S1/PT-S2相比，PT-S3具有較低的己糖M+6（[U-13C6]己糖）和較高的乳酸M+3（[13C3]乳酸）富集度（圖3d）。此外，作者發(fā)現(xiàn)R5P/X5PM+3（糖酵解分支）的富集程度較低，而在PT-S3中進入三糖酸循環(huán)的谷氨酸的富集程度較低（圖3d）。

PT-S3中谷氨酰胺含量較低，與PT-S1/PT-S2細胞相比，谷氨酸富集量較高（圖3e）。值得注意的是，來自同一樣品的PT-S3中[13C4]蘋果酸和[13C3]谷氨酸[13谷氨酸的富集相對低于PT-S1/PT-S2，表明[U-13C5]谷氨酰胺和[13C5]谷氨酸對PT-S3氧化TCA循環(huán)的貢獻較低（圖3e）。在PT-S3中，亞油酸[U-13C18]通過脂肪酸氧化對[13C2]谷氨酸同位素的貢獻也較低（圖3f)。結(jié)合這些數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)[U-13C5]谷氨酰胺，而不是[U-13C6]葡萄糖或[U-13C18]亞油酸鹽，是谷氨酸在所有PT區(qū)谷氨酸的主要碳源（圖3g）。

圖3 | 假腎PT細胞的動態(tài)代謝測量

4.bIRI腎PT細胞的動態(tài)代謝測量

作者試圖通過比較健康的PT（LTL+VCAM1-）和適應(yīng)不良修復(fù)失敗的PT（VCAM1+；FR_PT），來確定bIRI后的代謝（不良）適應(yīng)（圖4a）。在空間代謝組學(xué)研究之后，作者選擇了所有的PT像素，根據(jù)LTL、VCAM1和KIM1 IF染色來確定（圖4b）。根據(jù)脂質(zhì)譜分析，隨后可以鑒定出四種PT類型：LTL+VCAM1-KIM1-（PT-S1/S2）和LTL+VCAM1+（FR_PT1），外髓質(zhì)外條紋的LTL-VCAM1+（FR_PT2和FR_PT3）和LTL+（PT-S3）（圖4c，d）。根據(jù)皮質(zhì)譜，皮質(zhì)區(qū)域的簇顯示了不適應(yīng)修復(fù)的軌跡（圖4e）。

然后，作者計算了偽時間分數(shù)與幾種同位素的13C富集的相關(guān)性（圖4f）。從健康PT區(qū)域向逐漸受損的PT區(qū)域的軌跡之后，偽時間評分與[U-13C6]己糖富集（平均r=-0.56，P<0.001）及其下游產(chǎn)物谷氨酸（平均r=-0.38，P<0.001）呈負相關(guān)，但與[13C3]乳酸富集（平均r=0.22，P<0.001），以及FR_PT中更多的總?cè)樗岽嬖冢▓D4j）。一種可能的解釋是，在FRPT中，糖酵解通量較高，而[U-13c6]葡萄糖對TCA循環(huán)的貢獻較低（圖4f，g，i），盡管不能排除其他來源對總?cè)樗嵊胸暙I。在氧化TCA循環(huán)中，還觀察到[U-13C5]谷氨酰胺富集和標記谷氨酰胺衍生的同位素也有所減少（圖4f，h，j），但與葡萄糖和亞油酸相比，谷氨酰胺仍然是FR_PT中谷氨酸的主要碳源（圖4k）。

圖4 | bIRI腎PT細胞的動態(tài)代謝測量

研究結(jié)論

• 開發(fā)了一個平臺來檢測單細胞分辨率下細胞類型特有的動態(tài)代謝變化。

• 證明該平臺可應(yīng)用于組織樣本，可以識別單個細胞類型內(nèi)的微環(huán)境的代謝異質(zhì)性。

• 設(shè)計的方法可以用于研究一般的組織穩(wěn)態(tài)，檢測細胞特異性代謝的變化。

  此前，單細胞代謝組學(xué)研究集中于分析單時間點代謝“快照”，但關(guān)鍵是缺乏對細胞代謝動態(tài)成分的洞察。本文采用高空間分辨率空間代謝組學(xué)平臺，使用同位素追蹤，允許原位細胞類型特異性的動態(tài)代謝測量，以揭示細胞所在組織結(jié)構(gòu)中的細胞脂質(zhì)代謝的變化。因此，為后續(xù)研究提供真正全面理解生化改變和細胞類型特異性功能、代謝通量和動態(tài)解釋之間相互作用的方法。

  
  

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