? ? ? ? 顯微直接計(jì)數(shù)法：將少量待測(cè)樣品懸浮液置于計(jì)菌器上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。

? ? ? ? 顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等, 菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤細(xì)菌計(jì)數(shù)板或Hawksley計(jì)數(shù)板。三種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血細(xì)胞計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。

? ? ? ? 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間較寬的平臺(tái)，被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)（大方格）分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。計(jì)數(shù)區(qū)由400個(gè)小方格組成。

? ? ?? 每個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，其面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋載玻片間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，通常測(cè)定五（或四）個(gè)中方格的微生物數(shù)量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一個(gè)大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1毫升菌液中微生物的數(shù)量。因此：每mL菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)(cell/mL)=一個(gè)大方格的總菌數(shù)×10的4次方×菌液稀釋倍數(shù)(d)。

? ? ? ? 若要區(qū)分計(jì)數(shù)樣品中的死菌和活菌值，則可采用微生物的活體染色法?；铙w染色法就是用對(duì)微生物無(wú)毒性的染料（如美藍(lán)、剛果紅、中性紅等染料）配成一定的濃度，再與一定量的菌液混合，經(jīng)一段時(shí)間后，死菌和活菌會(huì)呈現(xiàn)出不同的顏色，這樣便可在顯微鏡下區(qū)分活菌數(shù)與死菌數(shù)。

? ? ? ? 美藍(lán)當(dāng)它處于氧化態(tài)時(shí)呈藍(lán)色，還原態(tài)時(shí)為無(wú)色。用它進(jìn)行活體染色時(shí)，由于活細(xì)胞代謝過(guò)程中的脫氫作用，美藍(lán)接受氫后就由氧化態(tài)轉(zhuǎn)變成還原態(tài)，因此活細(xì)胞呈現(xiàn)無(wú)色，而衰老或死亡的細(xì)胞由于代謝緩慢或停止，不能使美藍(lán)還原，故細(xì)胞呈淡藍(lán)色或藍(lán)色。

實(shí)驗(yàn)步驟:

1. 鏡檢血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

2. 血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，將酵母菌懸液搖勻，用無(wú)菌滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一滴，使菌液滲入計(jì)數(shù)室 。

3. 將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置載物臺(tái)上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù) 。

4. 計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)由16個(gè)中方格組成，按對(duì)角線(xiàn)方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)中方格（即100小格）的菌數(shù)。如為25個(gè)中方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)中央l個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格） 。

5.根據(jù)顏色區(qū)別死活細(xì)胞，染色30min后再次觀察，注意死活細(xì)胞數(shù)量的變化。

1. 鏡檢血球計(jì)數(shù)板（先10倍后40倍）

低倍鏡（10倍）下觀察→找到A的位置→高倍鏡（40倍）下觀察→找到B的位置→若計(jì)數(shù)室的格中不干凈→擦凈計(jì)數(shù)室（酒精棉C）

2.加菌液到計(jì)數(shù)區(qū)

3. 鏡檢加菌的計(jì)數(shù)室

4.按照左上→找出左上→右上→左下→右下→中間進(jìn)行計(jì)數(shù)（25×16格）

注意事項(xiàng):

1. 如菌體位于大方格的雙線(xiàn)上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線(xiàn)不數(shù)下線(xiàn)，數(shù)左線(xiàn)不數(shù)右線(xiàn)，以減少誤差。

2. 對(duì)于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。

3. 清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用后，用自來(lái)水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95％的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過(guò)鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。