眾所周知，橫斷脊髓損傷 (SCI) 可能導(dǎo)致?lián)p傷下方脊髓的神經(jīng)支配喪失、神經(jīng)功能性沉默。已有研究證明，對(duì) SCI 大鼠進(jìn)行調(diào)制中頻尾神經(jīng)電刺激 (TNES) 可有效保護(hù)受損的 L1-L5 脊髓神經(jīng)元，并防止后肢肌肉萎縮。然而，與沒有任何干預(yù)的 SCI 大鼠相比，TNES 后 SCI（E-SCI）大鼠的運(yùn)動(dòng)功能沒有顯著恢復(fù)，這可能與腦源性神經(jīng)信號(hào)向 SCI 部位以下的脊髓神經(jīng)元傳遞效率較低有關(guān)。

然而，目前仍然嚴(yán)重缺乏在 SCI 部位誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元或髓鞘細(xì)胞的合適方法，且針對(duì)TNES相關(guān)神經(jīng)回路及其機(jī)制的研究相對(duì)較少。

為解決此類問題, 2023年3月，中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎系曾園山實(shí)驗(yàn)室在Biomaterials上發(fā)表文章，他們探討了 SCLT 移植聯(lián)合 TNES （E-SCLT）是否可以促進(jìn)神經(jīng)回路的修復(fù)和功能激活，并揭示這些方法協(xié)同促進(jìn)自主運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的機(jī)制。

文章主要內(nèi)容：

1構(gòu)建SCLT神經(jīng)元

通過基因修飾和3D培養(yǎng)技術(shù)，研究者構(gòu)建出白質(zhì)樣組織和灰質(zhì)樣組織，將兩種組織進(jìn)行共培養(yǎng)后構(gòu)建出SCLT 神經(jīng)元。研究人員用各種方法驗(yàn)證了SCLT 神經(jīng)元的功能的完整性：包括高表達(dá)的突觸標(biāo)志蛋白PSD95和SYP；電子顯微鏡顯示SCLT 神經(jīng)元在14天時(shí)已與鄰近細(xì)胞接觸，并建立了突觸連接；觀察到成熟突觸的特征，包括軸突末端的突觸小泡、突觸后致密物的形成和膜增厚。通過全細(xì)胞記錄動(dòng)作電位和突觸傳遞，研究者記錄到用兩種不同電流注射誘導(dǎo)的動(dòng)作電位，檢測到微小興奮性、抑制性突觸后電流（mEPSCs、mIPSCs），表明分化的 SCLT 神經(jīng)元成熟，形成興奮--抑制神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

為了可視化 SCLT 中谷氨酸的動(dòng)態(tài)釋放，研究人員還利用用谷氨酸傳感器 iGluSnFR 技術(shù)，證明高鉀刺激能夠誘發(fā)SCLT 中的谷氨酸釋放（圖1）。

圖1：SCLT模擬脊髓組織的構(gòu)建

2行為學(xué)驗(yàn)證SCLT移植結(jié)合TNES治療能夠改善運(yùn)動(dòng)功能

在大鼠T10處，從完全脊髓橫斷部位切除2mm脊髓，導(dǎo)致其后肢完全癱瘓。然后將SCLT移植到受傷造成的間隙內(nèi)，在手術(shù)和移植后8天開始TNES治療，每周進(jìn)行5次，持續(xù)8周。單獨(dú)接受 TNES （E-SCI）和同時(shí)進(jìn)行SCLT 植入物的大鼠（E-SCLT）都表現(xiàn)出了明顯的后肢反射。此外，E-SCLT組表現(xiàn)出了最強(qiáng)的放置反射，E-SCLT 組中的大鼠在靜止姿勢期間用后肢支撐體重，表明當(dāng)用 TNES 和 SCLT 的組合治療大鼠時(shí)，可以保留更多的肌肉力量。

此外，研究者觀察到接受 TNES 8 周的大鼠腓腸肌和脛骨前肌萎縮較少。經(jīng)過治療的大鼠可以通過后肢重量支撐移動(dòng)三個(gè)關(guān)節(jié)，表明 TNES 是緩解 SCI 后后肢肌肉萎縮的潛在策略（圖2）。

圖2: 行為、肌肉濕重和電生理結(jié)果的分析

3 SCLT移植結(jié)合TNES治療在組織學(xué)上的改善

研究者發(fā)現(xiàn)移植的SCLT與脊髓結(jié)合良好，植入物和宿主組織之間沒有間隙。與 SCLT 組相比，E-SCLT 組中更多的神經(jīng)纖維被 MBP+ 細(xì)胞包裹。E-SCI 組進(jìn)行 TNES 治療后，損傷部位的神經(jīng)纖維生長和髓鞘形成均得到改善。

為了進(jìn)一步確定 TNES 對(duì)腰椎脊髓神經(jīng)元的影響，研究者比較了 SCLT 和 E-SCLT 組腰椎脊髓神經(jīng)元激活相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，活動(dòng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白（Arc，神經(jīng)元突觸可塑性的標(biāo)志物）均勻分布在脊髓前角和后角。與 SCLT 組相比，E-SCLT 組脊髓 L2 和 L5 節(jié)段的 Arc 表達(dá)更高。c-Fos在 E-SCLT 組的脊髓 L2 和 L5 節(jié)段中高水平表達(dá)，但在SCLT 組中未檢測到。

此外，因?yàn)榕d奮性神經(jīng)傳遞與運(yùn)動(dòng)功能有關(guān)，研究者用免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析了谷氨酰胺能神經(jīng)纖維的變化，結(jié)果顯示：與SCI組相比，E-SCI、SCLT和E-SCLT組尾部損傷/移植部位的VGluT1+神經(jīng)纖維更多。雖然在 SCLT 和 E-SCLT 組的損傷/移植部位的延髓區(qū)域檢測到的 VGluT1+ 神經(jīng)纖維數(shù)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而，它們的數(shù)量明顯多于 SCI 和 E-SCI 組，表明SCLT 移植聯(lián)合 TNES 可促進(jìn)受損脊髓中 VGluT1+ 神經(jīng)纖維的再生。

最后，研究者利用蛋白質(zhì)印跡測試了SCI后癱瘓后肢的肌肉神經(jīng)支配和氧化能力，E-SCLT組同樣在這些方面顯示出較強(qiáng)能力。

4 脊髓損傷神經(jīng)元連接的逆行神經(jīng)通路追蹤與分析

為確定 TNES 對(duì)控制后肢行為的下胸腰段脊髓神經(jīng)元和損傷/移植部位傳輸神經(jīng)信息的供體神經(jīng)元影響，研究者將逆行示蹤劑 FG 注射到坐骨神經(jīng)，PRV注射到尾神經(jīng)。結(jié)果顯示，腰骶脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與 CPG 神經(jīng)元形成神經(jīng)回路。在 L4節(jié)段，一些運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分別與來自后肢和尾部的 FG 和 PRV 共同標(biāo)記，而其他運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元僅被FG 標(biāo)記。

為了確定從尾神經(jīng)接收電刺激的傳入通路，研究者將非跨突觸霍亂毒素 B (CTB) 注射到大鼠尾部，結(jié)果在 L2 段的背角中觀察到一些CTB+ 神經(jīng)纖維，并與EPHA4+/VGluT2+神經(jīng)元形成接觸，表明尾部確實(shí)能夠接收到電刺激（圖3）。

圖3: E-SCLT組胸腰椎下脊髓逆行追蹤神經(jīng)元連接

5總結(jié)

在本文中，研究者構(gòu)建了 SCI 大鼠模型，建立了神經(jīng)干細(xì)胞衍生的脊髓樣組織 (SCLT)，并評(píng)估其作為神經(jīng)元替代損傷脊髓和修復(fù)脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)的能力。同時(shí)結(jié)合電刺激尾神經(jīng) (TNES) 進(jìn)一步激活腰骶脊髓，以更好接收 SCLT 傳輸?shù)纳窠?jīng)信息。SCLT 和 TNES 的結(jié)合有望為 SCI 患者恢復(fù)自主運(yùn)動(dòng)和控制肌肉提供新的突破。

參考文獻(xiàn)：

Lai, Bi-Qin et al. “Tail nerve electrical stimulation promoted the efficiency of transplanted spinal cord-like tissue as a neuronal relay to repair the motor function of rats with transected spinal cord injury.” Biomaterials, vol. 297 122103. 28 Mar. 2023, doi:10.1016/j.biomaterials.2023.122103

文獻(xiàn)鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0142961223001114

編譯作者：brainnews創(chuàng)作團(tuán)隊(duì)

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