寫在前面

????????今天推薦的是由南開大學(xué)藥用化學(xué)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)在2019年1月1日發(fā)表于Theranostics（IF：8.393，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Cheng Yang教授，研究表明USP5通過穩(wěn)定肝細(xì)胞癌的SLUG促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

研究背景

????????肝細(xì)胞癌是最常見的惡性肝臟腫瘤，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞經(jīng)過EMT后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂星忠u能力的間質(zhì)表型，從而增加遷移能力。因此，抑制EMT是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要途徑。SLUG是一個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在EMT進(jìn)展中通過E-cadherin近端啟動(dòng)子的E-box元素抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。SLUG在腫瘤進(jìn)展過程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用已被徹底研究，但其精確的調(diào)控仍未被充分探索。

摘要部分

????????作者通過親和純化、質(zhì)譜分析和CO-IP來確定SLUG與泛素特異性蛋白酶5（USP5）之間的相互作用。去泛素化試驗(yàn)證實(shí)了USP5對(duì)SLUG去泛素的影響。采用雙熒光素酶報(bào)告法和染色質(zhì)免疫沉淀法來觀察USP5對(duì)SLUG的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。通過Western blotting和免疫熒光檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物。檢測(cè)了分子對(duì)接、SPR傳感器（biacore）和共定位，以證明芒柄花素針對(duì)USP5。通過生物信息學(xué)分析，研究了USP5和SLUG與HCC惡性程度的關(guān)系。在HCC細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞遷移、侵襲和裸鼠異種移植模型，以檢測(cè)USP5的促進(jìn)作用和芒柄花素對(duì)EMT的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)。USP5與SLUG相互作用并穩(wěn)定SLUG，通過USP5的去泛素化活動(dòng)在肝細(xì)胞癌（HCC）的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中調(diào)節(jié)其豐度。在惡性程度高的HCC中，USP5高度表達(dá)并與SLUG的表達(dá)呈正相關(guān)。敲除USP5可抑制SLUG的去泛素化，抑制HCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，而過量表達(dá)USP5可促進(jìn)SLUG的穩(wěn)定性和體外及體內(nèi)的EMT。通過虛擬篩選，作者發(fā)現(xiàn)芒柄花素與USP5有良好的結(jié)合。此外，芒柄花素抑制了USP5對(duì)SLUG的去泛素化活性，從而阻礙了HCC的EMT和惡性進(jìn)展。

研究?jī)?nèi)容

1.SLUG與USP5有相互作用? ? ?

????????為了全面了解SLUG的功能，作者進(jìn)行了親和純化和質(zhì)譜分析以確定SLUG的相互作用蛋白。USP5，一種去泛素化酶，被發(fā)現(xiàn)在含有SLUG的蛋白復(fù)合物中。為了探索SLUG和USP5之間的關(guān)系，在Hela細(xì)胞提取物中進(jìn)行了共同免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示SLUG與USP5有效地共同免疫沉淀。同時(shí)，USP5也與SLUG有效地共免疫沉淀。? ? ? ?

????????為了進(jìn)一步確認(rèn)SLUG和USP5之間的相互作用，作者進(jìn)行快速蛋白液相色譜（FPLC）實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，來自Hela細(xì)胞的原生SLUG被洗脫，其表觀分子質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單體蛋白的質(zhì)量。大部分SLUG與USP5共存于一個(gè)多蛋白復(fù)合物中。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中USP5和SLUG表達(dá)的相關(guān)性分析顯示，USP5和SLUG的表達(dá)水平與GEPIA數(shù)據(jù)庫中的TCGA HCC樣本呈正相關(guān)。? ? ?

????????另一方方面，根據(jù)PLC-PRF-5和Hep3B細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)或N-STORM用針對(duì)SLUG和USP5的抗體進(jìn)行免疫染色，準(zhǔn)確分析了這兩種蛋白的共定位。

研究結(jié)論：SLUG與USP5存在物理相互作用和空間共定位。

?

2.USP5通過其去泛素化功能穩(wěn)定SLUG??? ?

????????為了解USP5和SLUG之間的物理相互作用和空間共定位的功能意義，PLC-PRF-5和Hep3B細(xì)胞敲除或過量表達(dá)了USP5和SLUG。敲除USP5會(huì)降低SLUG的表達(dá)，而敲除SLUG時(shí)USP5的表達(dá)幾乎沒有變化，且SLUG蛋白水平的降低可以被蛋白酶體抑制劑MG132所回補(bǔ)。? ? ?

????????作者認(rèn)為USP5通過蛋白酶體抑制SLUG的降解來穩(wěn)定SLUG。為了證實(shí)這一點(diǎn)，作者進(jìn)行了環(huán)己酮（CHX）追逐試驗(yàn)，以檢測(cè)USP5敲除或過表達(dá)處理下SLUG的半衰期。結(jié)果顯示，在USP5缺陷的細(xì)胞中，SLUG的半衰期縮短。一致的是，USP5的過度表達(dá)延長了SLUG的半衰期。

????????考慮到USP5作為DUB的功能，作者推測(cè)USP5可能通過去泛素化SLUG來影響SLUG的穩(wěn)定性。去泛素化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在USP5過量表達(dá)的細(xì)胞中，SLUG蛋白上的泛素明顯減少，而當(dāng)USP5被敲除時(shí)，泛素相應(yīng)增加。

研究結(jié)論：USP5通過去泛素化SLUG促進(jìn)SLUG的穩(wěn)定。

?

3.USP5促進(jìn)肝細(xì)胞癌的EMT和轉(zhuǎn)移? ? ?

????????SLUG是EMT中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，通過抑制E-cadherin的表達(dá)促進(jìn)EMT的進(jìn)展。為了了解USP5介導(dǎo)的穩(wěn)定SLUG的生物學(xué)意義，作者研究了USP5對(duì)EMT的影響。ChIPBASE圖案分析顯示了SLUG的結(jié)合基序。染色質(zhì)IP（ChIP）檢測(cè)顯示，SLUG與E-cadherin啟動(dòng)子的結(jié)合在USP5缺陷的細(xì)胞中被明顯抑制。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，敲除USP5干擾了SLUG對(duì)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制，而過度表達(dá)USP5則相反。Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)，在敲除USP5的PLC-PRF-5和Hep3B細(xì)胞中，上皮標(biāo)志物（E-cadherin、cytokeratin和occludin）的表達(dá)水平增加，間質(zhì)標(biāo)志物（Vimentin、N-cadherin和myosin）的表達(dá)水平下降，而過度表達(dá)USP5，EMT相關(guān)標(biāo)志物有相應(yīng)變化。敲除USP5增加了E-cadherin的熒光強(qiáng)度，但減少了Vimentin的熒光強(qiáng)度，而在USP5過表達(dá)的細(xì)胞中，其結(jié)果正好相反。

????????為了確定USP5/SLUG在HCC體內(nèi)惡性進(jìn)展中的作用，將USP5缺陷或過表達(dá)的PLC-PRF-5和Hep3B細(xì)胞皮下移植到裸鼠體內(nèi)，建立異種移植模型。腫瘤的生長在接受腫瘤移植的裸體小鼠中被抑制，而在接受腫瘤移植的小鼠中，USP5過度表達(dá)的腫瘤生長被促進(jìn)。敲除USP5組的腫瘤重量減少，而USP5過表達(dá)組的腫瘤重量增加。最后，作者用免疫組織化學(xué)（IHC）染色法檢查了異種移植中USP5、SLUG、E-cadherin、Vimentin和Ki67的表達(dá)水平。

研究結(jié)論：USP5促進(jìn)了肝細(xì)胞癌的生長和轉(zhuǎn)移。

?

4.USP5和SLUG的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的惡性程度有關(guān)

????????作者接下來對(duì)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以證實(shí)USP5/SLUG軸在HCC中的作用。通過對(duì)人類蛋白質(zhì)圖譜的免疫組化檢測(cè)的代表圖像和評(píng)分發(fā)現(xiàn)，USP5和SLUG在腫瘤中的表達(dá)高于正常肝組織。UALCAN數(shù)據(jù)庫對(duì)TCGA樣本的癌癥轉(zhuǎn)錄分析也顯示，與正常肝組織相比，USP5和SLUG在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)很高。同時(shí)，USP5和SLUG的表達(dá)與TCGA肝細(xì)胞癌樣本的臨床分期和病理分級(jí)呈正相關(guān)。生存分析也顯示，USP5和SLUG的高表達(dá)表明預(yù)后不佳。USP5與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和EMT相關(guān)標(biāo)志物（TWIST1、Vimentin、MMP2、MMP9和N-cadherin）的相關(guān)性分析顯示，USP5的表達(dá)與EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

研究結(jié)論：SP5/SLUG軸促進(jìn)了HCC患者的惡性進(jìn)展，因此支持將USP5/SLUG作為HCC治療的潛在目標(biāo)。

?

5.芒柄花素以USP5為靶點(diǎn)抑制SLUG的去泛素化? ? ?

????????作者通過分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示芒柄花素在100ns內(nèi)A5B與USP5結(jié)合的動(dòng)態(tài)變化。分子對(duì)接結(jié)果顯示，在USP家族成員中，芒柄花素對(duì)USP5的結(jié)合達(dá)到了最高的性能。同時(shí)作者研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花素-探針、USP5和SLUG相互之間是共定位方法。為了進(jìn)一步驗(yàn)證USP5是否與芒柄花素作用，作者進(jìn)行了Biacore實(shí)驗(yàn)。解離常數(shù)（Kd值）為25.1 μM。所有的結(jié)果證明，芒柄花素針對(duì)USP5 。

????????為了探討芒柄花素對(duì)USP5/SLUG軸的影響，用不同濃度的芒柄花素處理的-PRF-5細(xì)胞進(jìn)行WB分析。結(jié)果證明，SLUG的表達(dá)水平下降。作者還進(jìn)行了泛素化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)芒柄花素處理的PLC-PRF-5細(xì)胞中SLUG的泛素，結(jié)果表明在芒柄花素處理組，SLUG的泛素增加。

研究結(jié)論：芒柄花素以USP5為目標(biāo)，抑制SLUG的去泛素化。

?

6.芒柄花素抑制肝細(xì)胞癌的EMT? ? ?

????????為了研究芒柄花素對(duì)抑制USP5的影響，在用不同濃度的芒柄花素處理的細(xì)胞中進(jìn)行了ChIP檢測(cè)。結(jié)果顯示，芒柄花素處理抑制了SLUG與E-cadherin啟動(dòng)子的結(jié)合。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，芒柄花素以劑量依賴的方式增加E-cadherin的轉(zhuǎn)錄活性。掃描電子顯微鏡（SEM）檢測(cè)顯示，芒柄花素處理刺激了細(xì)胞表型從間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀け硇?。這一結(jié)果也得到了Western blot分析的支持。

????????western blot分析進(jìn)一步顯示，芒柄花素處理提高了PLC-PRF-5和Hep3B細(xì)胞中上皮標(biāo)志物的表達(dá)水平，降低了間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)水平。此外，PLC-PRF-5和Hep3B細(xì)胞的集落形成、Transwell和傷口愈合試驗(yàn)顯示，芒柄花素抑制了HCC細(xì)胞的集落形成、遷移和入侵。

研究結(jié)論：芒柄花素抑制肝細(xì)胞癌的EMT。

?

結(jié)論與討論

????????總之，作者首次揭示了USP5與SLUG的物理相互作用，并通過其去泛素化活性穩(wěn)定SLUG。芒柄花素通過抑制USP5對(duì)HCC中SLUG的去泛素化作用，顯示出良好的抗腫瘤活性。進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以獲得性能更好的化合物對(duì)開發(fā)針對(duì)USP5/SLUG的臨床抗腫瘤藥物具有重要意義。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://www.thno.org/v09p0573.htm