生殖細(xì)胞是通過減數(shù)分裂的特殊形式制造出來的，卵母細(xì)胞的形成方法名為卵母細(xì)胞生成。在早期的胚胎發(fā)育中，原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移至生殖嵴后轉(zhuǎn)化為卵原細(xì)胞，并與體細(xì)胞結(jié)合，在減數(shù)分裂中發(fā)育為卵母細(xì)胞。而生殖嵴也隨之發(fā)育為性腺，為卵原細(xì)胞提供生長信號，伴隨著顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分化，卵泡結(jié)構(gòu)最終形成。

因此，生殖細(xì)胞的發(fā)育是一個(gè)精密而又復(fù)雜的過程，人們也在這奇妙的發(fā)育過程中不斷進(jìn)行著探索。2021年7月，日本九州大學(xué)的吉野隆史及其團(tuán)隊(duì)在?Science?發(fā)表了題為?Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells?的論文，該研究報(bào)道了一種體外構(gòu)建重組卵巢體的培養(yǎng)體系，并使用該卵巢體成功在體外環(huán)境促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，形成卵泡結(jié)構(gòu)。

該團(tuán)隊(duì)此前便致力于生殖細(xì)胞發(fā)育的研究，于2012年和2016年分別開發(fā)了在體內(nèi)和體外使用胚胎細(xì)胞通過誘導(dǎo)使其發(fā)育為卵母細(xì)胞的培養(yǎng)體系。而在2021年更進(jìn)一步，體外構(gòu)建卵巢體，為細(xì)胞發(fā)育的研究提供新的模型和培養(yǎng)思路。

為了評估最適的培養(yǎng)條件，首先，作者針對性腺體細(xì)胞前體，中間中胚層（IMM）細(xì)胞的Pdgfra進(jìn)行標(biāo)記探測，使用TGFP熒光標(biāo)記的誘導(dǎo)分化的上胚層樣細(xì)胞在進(jìn)行培養(yǎng)。在添加BMP4和WNT激動劑CHIR99021的不同濃度組合的培養(yǎng)結(jié)果中，作者發(fā)現(xiàn)上胚層養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)第二天后的消失，以及Pdgfra在培養(yǎng)第四天后的持續(xù)存在，這一現(xiàn)象表明了細(xì)胞分化的發(fā)生。（圖1）

圖1. TGFP和Pdgfra標(biāo)記在細(xì)胞培養(yǎng)中的變化

隨后，作者通過使用Foxf1 tdTomato/Osr1-GFP報(bào)告ESCs（圖S3A），監(jiān)測中間中胚層（IMM）標(biāo)記Osr1和側(cè)板中胚層（LPM）標(biāo)記Foxf1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者同時(shí)受到BMP4和CHIR99021的計(jì)量調(diào)控。不同于Foxf1在高濃度BMP4中的大量表達(dá)，Osr1受CHIR99021的高濃度誘導(dǎo)，卻隨BMP4的濃度升高而下調(diào)?？紤]到在這兩種因子調(diào)控下，近軸中胚層（PM）細(xì)胞無法生長，而IMM與LPM細(xì)胞被互斥調(diào)控，為了獲得大量的IMM細(xì)胞，作者將BMP4和CHIR的濃度分別固定在1 ng/ml和14 μM。（圖2）

圖2. 兩種因子對IMM和LPM細(xì)胞的互斥調(diào)控

接著，為了進(jìn)一步誘導(dǎo)IMM樣細(xì)胞向生殖嵴分化，作者添加了中胚層的前移介導(dǎo)因子視黃酸（RA），上胚層特化因子音猥因子（SHH），以及FGF抑制劑PD0325901（PD）以抑制后移發(fā)生。通過使用綠色熒光蛋白（GFP）和增強(qiáng)型青色熒光蛋白（ECFP）對IMM標(biāo)記Osr1和生殖嵴標(biāo)記Gata4進(jìn)行追蹤。FACS分析和Q-PCR顯示三種因子均能有效促進(jìn)Gata4 CFP陽性/Osr1-GFP低表達(dá)細(xì)胞，即向生殖嵴分化的中胚層細(xì)胞的數(shù)量，作者將RA、PD和SHH的濃度分別設(shè)定在3mM、1mM和30ng/ml，用于后續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。（圖3）

圖3. 卵巢體體外培養(yǎng)體系的確定

為了進(jìn)一步探究生殖嵴細(xì)胞的體外發(fā)育程度，作者選用了Nr5a1這個(gè)在所有生殖嵴所有細(xì)胞譜系中均有表達(dá)的標(biāo)記基因進(jìn)行更加嚴(yán)格的把控。作者從Nr5a1-hCD271細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得了雌性胚胎干細(xì)胞（ESC），同時(shí)又以tdTomato標(biāo)記顆粒細(xì)胞標(biāo)記基因Foxl2，并在上述培養(yǎng)條件下成功在第4天觀察到Nr5a1陽性細(xì)胞，隨后又在第6天檢測到Foxl2陽性細(xì)胞的出現(xiàn)。這一現(xiàn)象證明了生殖嵴的成功分化以及顆粒細(xì)胞的產(chǎn)生。考慮到體內(nèi)胚胎細(xì)胞發(fā)育到顆粒細(xì)胞的產(chǎn)生需約6.75天，體內(nèi)外細(xì)胞生長周期基本一致。（圖4）

圖4. 標(biāo)記基因顯示生殖嵴與顆粒細(xì)胞的成功發(fā)育

對于所獲細(xì)胞群，作者對通過MACS分選的Nr5a1-hCD271陽性細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序分析。通過將培養(yǎng)第6天的細(xì)胞與體內(nèi)E10.5至E14.5胚胎性腺中的細(xì)胞進(jìn)行比對，證明所獲培養(yǎng)物與體內(nèi)E11.5到E14.5的細(xì)胞基因表達(dá)譜類似，而表達(dá)基因也顯示了卵母細(xì)胞成熟過程中的關(guān)鍵細(xì)胞存在。進(jìn)一步，通過Nr5a1分選細(xì)胞，將所獲細(xì)胞進(jìn)行再次聚類，獲得表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞，顆粒細(xì)胞，以及生殖祖細(xì)胞的6大細(xì)胞類群。（圖5）

圖5. 培養(yǎng)物中的細(xì)胞類群

而通過與體內(nèi)細(xì)胞發(fā)育進(jìn)行比對，證明了細(xì)胞成分的一致性，因此，作者將Nr5a1-hCD271陽性細(xì)胞命名為胎兒卵巢體細(xì)胞樣細(xì)胞（FOSLCs）。為了驗(yàn)證所獲FOSLCs的功能，作者將其與小鼠多能干細(xì)胞來源的原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（PGCLC）按照體內(nèi)比例進(jìn)行混合，在體外分化培養(yǎng)條件（IVD）下進(jìn)行培養(yǎng)，最終觀察到卵母細(xì)胞的產(chǎn)生，因?yàn)樽髡邩?gòu)建的FOSLCs聚集成球體并能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，作者將其命名為重組卵巢體。通過以E12.5期的小鼠性腺體細(xì)胞作為對照，以BVSC作者觀察到重組卵巢體的卵母細(xì)胞形成數(shù)量有所下降，但是形成率率達(dá)到了100%。（圖6）

圖6. 卵母細(xì)胞在重組卵巢體中的形成

而進(jìn)一步地，F(xiàn)OSLC 的發(fā)育能力通過體外生長培養(yǎng) (IVG) 得到進(jìn)一步驗(yàn)證。在 IVG 培養(yǎng)中，F(xiàn)OSLC 衍生的顆粒細(xì)胞增殖并于 D12 形成卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體 (COC)，并形成跨透明帶結(jié)構(gòu) (TZP)，這對于支持卵母細(xì)胞生長的近分泌相互作用至關(guān)重要。而在體外成熟培養(yǎng)（IVM）條件下，F(xiàn)OSLC衍生的卵丘細(xì)胞被擴(kuò)增，這在卵丘細(xì)胞成熟過程中通?？梢杂^察到。隨后，28.4%（33/116）的分離卵母細(xì)胞隨著第一極體的擠壓進(jìn)入MII（第二次減數(shù)分裂階段）階段，并與體內(nèi)發(fā)育數(shù)據(jù)一致。最后，作者對所獲卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，并移植入雌鼠體內(nèi)，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)了受精卵的分裂，而親代與子代均能夠正常孕育后代。（圖7）

圖7. 卵丘，透明帶的形成與生殖細(xì)胞的發(fā)育

在這項(xiàng)研究中，作者通過完善體外條件，成功構(gòu)建出能夠模擬體內(nèi)卵巢細(xì)胞組成及功能的重組卵巢體，并使用該模型成功誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞的分化，并且，形成的卵母細(xì)胞也具有孕育后代的能力，顯示了卵巢體在一定程度上的完整性以及對體內(nèi)環(huán)境的高度模擬性。

這項(xiàng)研究使得人們在后續(xù)的發(fā)育生物學(xué)研究中無需從誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞起始，減少了實(shí)驗(yàn)周期，為胚胎性腺體細(xì)胞提供了新的來源。體外卵巢體為發(fā)育生物學(xué)研究以及體外細(xì)胞培養(yǎng)，模型構(gòu)建提供了新思路，并可能成為體外培養(yǎng)的一塊全新的拼圖。而該模型是否能夠長期重復(fù)使用，并打破遺傳的限制，也使科學(xué)家對此產(chǎn)生了新的期待。

▍以上內(nèi)容來自伯楨生物編輯部