編者按：

腫瘤分子分型：通過NGS、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)，對腫瘤進行分子譜的系統(tǒng)描繪，并根據(jù)分子特征譜，進行腫瘤的精準分類及精準診療研究。

分子分型已成為國家精準醫(yī)療戰(zhàn)略的重點研究投入方向；也備受CNS頂刊雜志青睞。

為了幫助廣大臨床研究者了解腫瘤分子分型及診療研究的重大前沿進展，我們收集整理了近幾年來發(fā)表于Cell、Nature、Cancer Cell等頂刊上的，基于蛋白質(zhì)組及蛋白基因組的腫瘤分子分型相關(guān)研究論文。

【腫瘤分子分型專輯】為大家精細解讀重磅研究與進展。

【癌種】：肝癌

【細分癌種】：HBV感染肝細胞癌（HBV-HCC）

【地域】：中國大陸

【通訊單位】：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院

【發(fā)表時間】：2019年

【涉及組學(xué)】：全外顯子、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、磷酸化修飾蛋白組

【文獻出處】：DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.038

主要成果

1. 從蛋白質(zhì)組水平定義了新的HBV-HCC分型，該分型能夠進行預(yù)后分層及治療分類

2. 系統(tǒng)鑒定了HBV-HCC的肝臟特異性蛋白組和代謝過程的變化

3. 系統(tǒng)描繪了HBV-HCC的關(guān)鍵信號與代謝通路的多組學(xué)圖譜

4. 發(fā)現(xiàn)了CTNNB1 突變相關(guān)的ALDOA磷酸化對HCC細胞增殖的促進作用及機理

疾病背景

【流行病學(xué)】：肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因。肝細胞癌（HCC）占所有原發(fā)性肝惡性腫瘤的約85％–90％，主要為乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染，以及酗酒和代謝綜合癥。目前的抗病毒療法只能降低而不能消除HBV，據(jù)估計全球HBV感染人數(shù)為292,000,000。值得注意的是，HBV相關(guān)的HCC約占中國HCC病例的85％。

【主要驅(qū)動基因】：TP53，CTNNB1，TERT promoter

研究設(shè)計

【主要樣本】：HBV-肝細胞癌病人經(jīng)手術(shù)切除的癌組織 VS 癌旁組織

【樣本狀態(tài)】：新鮮冰凍

【樣本數(shù)量】：158 paired

【治療干預(yù)】：手術(shù)前未經(jīng)放化療等干預(yù)

【主要研究路線與內(nèi)容】：

1. 單組學(xué)分析：

組別：癌 VS 癌旁

WES：基因拷貝數(shù)、基因突變；（1）中國人群HBV特有突變；（2）馬兜鈴酸相關(guān)特有突變

TMT蛋白組：蛋白鑒定與定量數(shù)量；蛋白組與mRNA相關(guān)性分析

TMT磷酸化蛋白組：修飾蛋白、修飾肽段鑒定與定量數(shù)量

2. 整合分析：

主要研究結(jié)果

一、多組學(xué)檢測結(jié)果的統(tǒng)計

二、基因突變情況

1. 主要有5個顯著的突變基因：TP53 (58%)、CTNNB1 (19%)、AXIN1 (18%)、KEAP1 (7%)、和RB1（6%）

Genetic profile and associated clinicopathologic features of all the 159 HCC patients

2. 中國人群的HBV-HCC特有突變特征，通過與TCGA數(shù)據(jù)比較：AXIN1、TSC2、 smARCA2等突變頻率更高，而CTNNB1、ARID1A、RB1突變頻率略低。

Comparisons of frequently mutated genes between CHCC-HBV cohort and TCGA HCC cohort

3. 馬兜鈴酸相關(guān)突變：被認為是肝癌的誘導(dǎo)因素，而且中國HBV肝癌人群中預(yù)計有80%以上使用過馬兜鈴酸相關(guān)藥物進行肝炎的治療，因此進一步分析了馬兜鈴酸相關(guān)突變：（1）馬兜鈴酸主要誘導(dǎo)A:T >T:A轉(zhuǎn)變；（2）馬兜鈴酸相關(guān)腫瘤比非腫瘤，具有更高的腫瘤突變負荷（TMB）及預(yù)測的新生抗原數(shù)；（3）馬兜鈴酸相關(guān)腫瘤具有更多的免疫細胞侵入，及更高的免疫調(diào)控蛋白表達。

Comparisons of TMB and predicted neoantigens in tumors with and without AA signatureComparisons of CD8+ T cells and immune regulatory molecules in tumors with and without AA signature

結(jié)論

鑒定了中國人群HBV-HCC的主要基因突變；同時鑒定了廣泛使用的馬兜鈴酸所誘導(dǎo)的基因突變情況，并提示該類病人接受免疫治療獲益的可能性。

三、HBV-CC的蛋白基因組分析：基因拷貝數(shù)變化（CNA）與mRNA/蛋白/磷酸化的表達關(guān)聯(lián)

1. CNA的cis & trans調(diào)控：cis調(diào)控是指，A基因變化調(diào)控A基因的mRNA、蛋白與磷酸化變化；trans調(diào)控是指，A基因變化影響B(tài)基因等其他基因的mRNA、蛋白與磷酸化變化。如果基因突變或基因拷貝數(shù)的變化，與蛋白、磷酸化修飾的表達的不一致性，可能是部分基因指導(dǎo)效果不理想的原因之一。

Correlations of CNA (x axes) to mRNA (left) and protein (right) expression (y axes) with CNA cis and trans effects

2. CNA的cis調(diào)控：

（1）具有cis調(diào)控作用的基因比例：CNA-mRNA（48%）、CNA-protein（46%）、CNA-磷酸化（30%）

（2）CNA-mRNA的相關(guān)性（中位數(shù)僅0.33）>CNA-protein的相關(guān)性（中位數(shù)僅0.21）；19.5%的基因存在CNA-mRNA到protein的表達斷層；這些斷層多屬于蛋白復(fù)合體（如ribosome and spliceosome）相關(guān)蛋白，可能因為與翻譯后修飾及蛋白半衰期有關(guān)。

Scatterplot of CNA correlation to mRNA and protein

3.CNA的trans調(diào)控：

（1）具有trans調(diào)控作用的基因比例：CNA-mRNA（72%）、CNA-protein（44%）、CNA-磷酸化（28%）

（2）主要deletion主要存在于染色體4q and 16q，并同時存在mRNA-蛋白的負相關(guān)表達；這些負相關(guān)與泛素化調(diào)控有關(guān)，例如泛素化對細胞周期的調(diào)控。

Venn diagrams of mRNAs/proteins with negative CNA-mRNA and CNA-protein correlations in chromosomes 4q

Enrichment analysis of proteins with negative CNA-protein correlation in chromosomes 4q

Heatmaps of copy-number loss of chromosomes 4q and the mRNA(m)/protein(p) abundance of UPS and cell-cycle-related proteins

結(jié)論

與已報道的其他研究結(jié)果相近，基因拷貝數(shù)變化與蛋白表達變化僅具有部分相關(guān)性，整體相關(guān)性較低。因此，腫瘤相關(guān)的基因信息，需要結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)果做進一步的確認與應(yīng)用，可能是基因指導(dǎo)的診療需要注意的。

四、基于蛋白質(zhì)組的腫瘤分型分析：

1. ?基于蛋白組的腫瘤分型：對腫瘤組織中異常表達的蛋白進行非監(jiān)督的聚類分析，共鑒定到3個腫瘤亞型：代謝型（S-Mb）、微環(huán)境失調(diào)型（S-Me）、增殖型（S-Pf）。主要突變基因RB1與TSC2富集于S-Pf 和S-Me型；病理相關(guān)指標，如腫瘤大小、癌栓、晚期TNM分期，集中于S-Pf型；S-Mb型的基因組相對更穩(wěn)定；S-Mb型具有最高的TMB和新生抗原預(yù)測，可能從免疫檢查點阻斷治療中獲益。

Patient subgrouping based on differentially expressed proteins

2. 分型的預(yù)后分析：

（1）三個腫瘤亞型的生存率存在顯著差異，并且是獨立于AFP、腫瘤大小、癌栓、 BCLC分型與TNM 分期的預(yù)后因子。

（2）根據(jù)TNM分期對患者進行分層，無論腫瘤分期如何，蛋白組亞型仍與患者的預(yù)后密切相關(guān)。利用本蛋白組特征對TCGA HCC mRNA數(shù)據(jù)進行分類，其生存差異與本研究相似。

（3）對于肝癌最重要的病理特征—癌栓：與癌栓有關(guān)的蛋白有82個，包括參與代謝重編程、過氧化物酶體和肝功能。

The heatmap (E) and enriched pathways (F) of significantly differential expressed proteins in tumors with or without tumor thrombus

結(jié)論

蛋白質(zhì)組能夠?qū)BV-HCC進行亞型分類，不同亞型具有不同的分子、病理等特征?；诘鞍踪|(zhì)組的各亞型存在顯著的生存差異，從而支持了蛋白質(zhì)組分子特征具有的優(yōu)越預(yù)后能力。

五、預(yù)后標志物篩選和驗證：

1. ?標志物篩選：基于嚴格的多維度的篩選，選擇了2個具有亞型表達特征的潛在預(yù)后標志物—PYCR2和ADH1A。

Workflow for selecting prognostic proteins. Relative abundance of PYCR2 and ADH1A between tumor and non-tumor tissues (t test) as well as across proteomic subgroups

2. 潛在標志物具有明顯的生存差異分層：組織微陣列的免疫組化顯示，其確實存在腫瘤組織特征表達。

Kaplan-Meier curves for overall survival based on proteomic abundance (n = 159; solid lines) or immunostaining scores

Representative multiplex immunostaining images of PYCR2 and ADH1A on tumor and paired non-tumor liver tissues

3. 預(yù)后標志物驗證：243例病人的隊列進行標志物預(yù)后能力的獨立驗證

Kaplan-Meier curves for overall survival based on immunostaining scores of PYCR2 and ADH1A in an independent HCC cohort

4. 預(yù)后標志物相關(guān)的多組學(xué)分子表達、功能與病理情況：例如PYCR2高表達的患者表現(xiàn)出顯著的癌栓、更大的腫瘤體積和更多的TP53或TSC2突變，以及多屬于晚期TNM階段。功能方面，代謝和過氧化物酶體相關(guān)的途徑下調(diào)，而DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)運和錯配修復(fù)相關(guān)的功能上調(diào)。

Associations of PYCR2 (F) expression with proteomic subgroups, clinicopathologic factors, and multi-omics profiles

結(jié)論

利用蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了2個預(yù)后標志物，且標志物的表達水平與相關(guān)的分子及病理有顯著相關(guān)性。

六、解析HBV相關(guān)蛋白與肝特異性蛋白組：

1. ?HBV相關(guān)蛋白：（1）在蛋白質(zhì)組學(xué)和RNA-seq數(shù)據(jù)中均檢測到大包膜蛋白，外部核心抗原/衣殼蛋白和聚合酶蛋白，而僅在RNA-seq數(shù)據(jù)中檢測到X蛋白；（2）有意思的是，在蛋白和mRNA水平，HBV蛋白及其受體SLC10A1均在腫瘤組織中表現(xiàn)出更低的表達，尤其是在S-Me、S-Pf型中。并且SLC10A1表達越高，預(yù)后越好。

Expression of HBV viral proteinsExpression of HBV viral mRNAs (C, n = 14; E, n = 72; P, n = 155; S, n = 69; X, n = 153, t test)Expression of SLC10A1 proteinKaplan-Meier curves for overall survival based on proteomic abundance or immunostaining scores of SLC10A1 in the current cohortKaplan-Meier curves for overall survival based on immunostaining scores of SLC10A1 in an independent HCC cohort

2. 膽汁酸代謝：?SLC10A1是一種肝特異性蛋白，主要起膽汁酸轉(zhuǎn)運體的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR、RXR功能受損所導(dǎo)致的膽汁酸代謝及HBV基因表達的抑制，是HBV-HCC的獨特分子特征。

Integrated analysis of key transcriptional factors, enzymes, and transporters in bile acid metabolism

3. 肝臟蛋白質(zhì)組：在檢測到的肝特異性蛋白中，有80.3％（290/361）在腫瘤中下調(diào)，并且肝特異性代謝途徑中的大多數(shù)蛋白在腫瘤中顯著減弱。但是，膽固醇合成關(guān)鍵酶SOAT1 / SOAT2則在S-Me和S-Pf亞型中上調(diào)，表明在更多的增生性腫瘤中，脂肪酸-膽固醇酯的合成代謝得到增強。GLS / GLUD2在S-Me和S-Pf中也顯示較高的表達，表明谷氨酰胺代謝可能在此類腫瘤中更活躍，以滿足其能量需求。

Differential expression of the liver-specific proteins among the three proteomic subgroupsHeatmap and quantitative analysis of differentially expressed proteins in the liver-specific functions

結(jié)論

描繪了HBV-HCC的肝臟特異性代謝的整體重編程。

七、描繪代謝通路與信號通路變化：

將mRNA、蛋白、磷酸化多個分子層面的數(shù)據(jù)進行整合，分別對整體水平、亞型和關(guān)鍵驅(qū)動基因的代謝和信號通路進行分析，發(fā)現(xiàn)：

1. 代謝通路方面：（1）糖酵解相關(guān)代謝酶增強，但TCA循環(huán)與氧化磷酸化的改變不完全協(xié)同；（2）脂質(zhì)合成相關(guān)酶增強；（3）膽固醇-膽汁酸代謝酶功能失調(diào)。

2. 信號通路方面：HCC相關(guān)信號如WNT、 Hippo-Yap、mTOR 已有較多研究，但本研究在臨床隊列水平上，進行了系統(tǒng)的蛋白與磷酸化分析。

Overview of metabolism and signaling pathways based on integrated proteogenomic analysis

3. 亞型的通路特征方面：S-Mb型富集于TCA循環(huán)、脂肪酸-脂質(zhì)代謝等，表現(xiàn)出代謝特征；S-Pf型富集于細胞增殖信號，表現(xiàn)出最前高的細胞再生活性；S-Me型具有較少的通路改變，表現(xiàn)出代謝與信號通路富集的混合狀態(tài)。

Integrated analysis of differentially activated metabolic and signaling pathways

4. TP53突變相關(guān)：在蛋白水平上，主要富集于代謝、細胞周期和DNA修復(fù)方面。但在磷酸化修飾水平上，卻沒有明顯的富集，說明TP53可能存在廣泛、復(fù)雜的通路機理。

Pathway enrichment analysis based on differentially expressed proteinsHeatmap represents protein phosphorylation sites

5. CTNNB1突變相關(guān)：主要富集于藥物代謝、糖酵解糖異生、氨基酸代謝等代謝通路，包括關(guān)鍵代謝酶ALDOA和ENO1的磷酸化增強。說明CNTTB1與肝癌異常代謝重編程相關(guān)。

Pathway enrichment analysis based on differentially expressed proteinsHeatmap represents protein phosphorylation sites

結(jié)論

在臨床隊列水平上，系統(tǒng)描繪了HBV-HCC的代謝與信號變化，其中不同亞型具有不同的代謝與信號通路特征。并進一步關(guān)注了重要驅(qū)動基因的相關(guān)代謝調(diào)控與信號通路。

八、關(guān)鍵驅(qū)動基因CTNNB1的新分子機理與功能：

CNTTB1是HCC的關(guān)鍵驅(qū)動基因，被發(fā)現(xiàn)與代謝調(diào)控有關(guān)，但其具體的分子機理尚不清楚。上述研究發(fā)現(xiàn)ALDOA Ser36位磷酸化在CNTTB1突變腫瘤樣本中有異常高表達（而蛋白水平則輕微低表達）。因此進一步進行了ALDOA Ser36位磷酸化與CTNNB1調(diào)控HCC代謝的及研究：

1. ?細胞實驗：利用細胞外酸化、細胞增殖實驗，證實ALDOA Ser36E磷酸化激活，影響肝癌細胞代謝與細胞增殖；進一步，ALDOA knockdown減少了CNTBB1對增殖的促進作用

2. ?動物實驗：發(fā)現(xiàn)ALDOA-S36E磷酸化激活細胞，形成更大的腫瘤體積。

結(jié)論

ALDOA相關(guān)代謝酶的磷酸化激活，介導(dǎo)了CTNNB1突變HCC的代謝重編程及細胞增殖。

總結(jié)

該研究使用配對的腫瘤和來自159名患者的相鄰肝組織進行了乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細胞癌（HCC）的首次蛋白質(zhì)組學(xué)表征。

（1）整合的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，在HBV相關(guān)的HCC中，關(guān)鍵信號通路的激活狀態(tài)以及肝臟特異性代謝重編程之間存在一致性和不一致。

（2）蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了與臨床和分子屬性相關(guān)的三個亞型。這些蛋白質(zhì)組亞型在代謝重編程、微環(huán)境失調(diào)、細胞增殖和潛在的治療方法中具有獨特的特征。

（3）研究鑒定了兩個預(yù)后生物標志物PYCR2和ADH1A，它們與蛋白質(zhì)組特征有關(guān)并且參與了HCC代謝重編程。

（4）揭示了CTNNB1和TP53突變相關(guān)的信號和代謝譜，其中CTNNB1突變相關(guān)的ALDOA磷酸化，被證實可促進代謝重編程和細胞增殖。

該研究研究提供了寶貴的資源，可極大地擴展與HBV相關(guān)的HCC的知識，并可能最終有益于臨床實踐。