腸道免疫系統(tǒng)主要由腸道菌群、腸道免疫細(xì)胞和腸道黏膜屏障等組成。其中腸道固有層發(fā)現(xiàn)了包括巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞等在內(nèi)的免疫細(xì)胞。

腸道免疫研究火熱，但想要制備高細(xì)胞活力的腸道免疫細(xì)胞樣本有一定的難度。今天給大家介紹一種小鼠腸道固有層淋巴細(xì)胞的分離與流式分析方法，此方法發(fā)表在STAR Protoc上。

一、實(shí)驗(yàn)用buffer

二、STEP1-2 取材、樣本制備

01 實(shí)驗(yàn)用鼠

• 8–12周雌雄 C57BL/6 小鼠

02 方法

• 取材

麻醉處死小鼠——解剖小鼠——取腸——放入含有預(yù)冷的5 mL HBSS（不含Ca2+，Mg2+）的孔板中（在HBSS中添加2%的胎牛血清可提高細(xì)胞活力）——?jiǎng)冸x脂肪組織和Peyer's斑塊、去除腸道內(nèi)容物——樣本放入預(yù)冷的HBSS中清洗兩次，并通過輕輕擦洗來清除粘液（盡量去除粘液）——轉(zhuǎn)移至新的含有預(yù)冷的5 mL HBSS（不含Ca2+，Mg2+）的孔板中。

取材過程

• 制樣

A.【去除上皮細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞】

①50 mL離心管中提前加入15 mL的EDTA-DTT buffer，預(yù)熱至37℃；

②將樣本放入離心管中并被EDTA-DTT buffer完全覆蓋；

③將離心管以45度角放于37℃的搖床中（250 rpm/15 min）；

④最大速度劇烈渦旋（3000 rpm/10 s）；

⑤提前準(zhǔn)備2個(gè)培養(yǎng)皿，并加入20 mL冰冷的RPMI-1640培基；

⑥將組織從EDTA-DTT緩沖液中取出，用干凈的吸水紙擦干殘留的溶液；

⑦用冰冷的RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗組織，然后用吸水紙擦洗。重復(fù)此步驟。

特別提示：如果上皮細(xì)胞或上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是所需的分析群體，可以用EDTA（用于腸上皮細(xì)胞）和DTT（用于上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞）緩沖液分別處理，每次處理后保存上清液。

B.【分離固有層淋巴細(xì)胞】

①50 mL離心管中提前加入5 mL的 digestion solution（現(xiàn)配現(xiàn)用，37℃預(yù)熱RPMI-1640），并將組織轉(zhuǎn)移至此管；

②將離心管以45度角放于37℃的搖床中（250 rpm/40 min-1 h），每15min劇烈搖晃一次，以提高消化效率（小腸消化35 min，大腸消化50 min）；

③將消化好的細(xì)胞懸液通過100 μm濾器過濾至新的50 mL離心管中，去掉部分組織團(tuán)塊，并且用15 mL冰冷的HBSS將原來的50 mL離心管沖洗干凈并過濾至新的管子中；

④離心細(xì)胞懸液（450g/10 min，4℃），棄上清；

⑤使用Percoll分離液分離出淋巴細(xì)胞，860 g /20 min，21℃ （lowest acceleration speed (acceleration 0 or 1) and no brake (deceleration 0)），小心吸取細(xì)胞。

⑥加入10 mL HBSS，4℃，450 g/10 min，棄上清；

三、Step3-4 流式分析

• 區(qū)分死活

• Fc受體阻斷

• 表面抗體

• 膜內(nèi)、核內(nèi)抗體

• 圈門思路

四、免費(fèi)領(lǐng)取腸上皮淋巴細(xì)胞分離與培養(yǎng)

除了腸道固有層淋巴細(xì)胞，有的老師也會(huì)關(guān)注到腸上皮淋巴細(xì)胞，具體的樣本制備和培養(yǎng)方法歡迎大家掃碼留咨獲?。?/p>

參考文獻(xiàn)

Kim E, Tran M, Sun Y, Huh JR. Isolation and analyses of lamina propria lymphocytes from mouse intestines. STAR Protoc. 2022 May 6;3(2):101366.?doi: 10.1016/j.xpro.2022.101366. PMID: 35573483; PMCID: PMC9097554.

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