高中生物及格

質(zhì)粒：細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA之外，能夠自主復(fù)制的DNA分子。

質(zhì)粒可以攜帶新的性狀如抗病毒、抗藥性、表達(dá)外源蛋白

質(zhì)粒對(duì)正常環(huán)境下的微生物沒有決定性作用

一個(gè)微生物承載過多外源質(zhì)粒會(huì)帶來生存劣勢(shì)（消除雜菌）

接合：細(xì)菌除了分裂以外還可以進(jìn)行有性生殖，該過程稱為接合（性菌毛：質(zhì)粒擴(kuò)散）

滾環(huán)復(fù)制

分子克?。哼z傳信息的復(fù)制粘貼

限制性內(nèi)切酶

平末端和黏性末端

平末端：易出問題，不推薦

黏性末端：穩(wěn)定，推薦

5‘黏性末端和3’黏性末端

酶：有酶，底物到產(chǎn)物，順反應(yīng)

無酶，產(chǎn)物到底物，逆反應(yīng)

相比有機(jī)合成，生物合成：能耗低，純度高

酶的機(jī)制：預(yù)存能量，按規(guī)則激發(fā)

酶的常見作用機(jī)制

胞外催化

理論上：

生命活動(dòng)完全來源于酶

所有酶促反應(yīng)都是化學(xué)反應(yīng)

酶能否工作與生命無關(guān)

只要有相應(yīng)的酶，就能在細(xì)胞外復(fù)制生命反應(yīng)

只要有基因序列，就能用微生物產(chǎn)酶

EcoR V二聚體 遇見 DNA 松散結(jié)合

發(fā)現(xiàn)特異性位點(diǎn) ，對(duì)DNA進(jìn)行精準(zhǔn)的切斷

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的特性：在哪里識(shí)別就在那里切割（識(shí)別位點(diǎn)及其附近2~6bp），最有工程價(jià)值

Ⅰ和Ⅲ型內(nèi)切酶：切割位點(diǎn)與識(shí)別位點(diǎn)分離（Ⅰ型切割較遠(yuǎn)，Ⅲ型20~50bp）

識(shí)別機(jī)制：

大溝和小溝

氫鍵的形成條件

氫鍵的本質(zhì)是氫質(zhì)子和極性原子之間的吸引力，有個(gè)矢量方向

量子化學(xué)

小溝：構(gòu)象特異性（無序列特異性）

作用：輕微吸引限制酶，引導(dǎo)松散結(jié)合

大溝：序列特異性

作用：強(qiáng)烈吸引限制酶，誘導(dǎo)強(qiáng)烈構(gòu)象變化

限制性內(nèi)切酶

原核生物獨(dú)有，除極少數(shù)病毒外，限制酶只在原核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，真核生物無限制酶

”限制”一詞來源于限制修飾系統(tǒng)，為原核生物獨(dú)有，用于對(duì)抗噬菌體

病毒的偷襲：甲基化、糖基化（糖基轉(zhuǎn)移酶）、靶向蛋白質(zhì)抑制限制酶

細(xì)菌的反制：某些細(xì)菌進(jìn)化出升級(jí)版限制修飾系統(tǒng)，可切割已修飾的DNA

酶切位點(diǎn)

合成片段

移碼突變：DNA鏈上插入或缺失的片段非3的倍數(shù)（后果非常嚴(yán)重，可致死）

防止移碼突變的重要原則：

1、插入或刪除的片段長度務(wù)必為3的倍數(shù)（實(shí)際上沒有）

2、要修改某個(gè)堿基，務(wù)必同時(shí)選中整組3個(gè)堿基（更常用）

翻譯過程

標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼

DNA的方向性

非對(duì)稱的DNA

腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）

TAA=（赭zhe石）終止密碼子

AAT=天冬氨酸

五環(huán)糖：非對(duì)稱

轉(zhuǎn)錄、翻譯、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)識(shí)別，方向性皆為從5‘端到3’端

SnapGene軟件默認(rèn)“上鏈”為“正方向”

多片段的順序和開放閱讀框

原核生物的調(diào)控片段

啟動(dòng)子>操縱子（產(chǎn)生遏阻蛋白）>片段A>片段B>片段C>終止子

1、缺一不可

2、順序不可調(diào)換

3、應(yīng)避免插入其他片段內(nèi)部

商業(yè)化的開放閱讀框

不涉及其它關(guān)鍵功能，存在大量酶切位點(diǎn)

質(zhì)粒（Plasmid）

文件名務(wù)必寫質(zhì)粒名

質(zhì)粒（環(huán)形）圖標(biāo)簽頁（左下角Map）

綠色的限制性酶切位點(diǎn)平末端

黑色的限制性酶切位點(diǎn)黏性末端

序列標(biāo)簽頁（左下角Sequence）

菜單欄

3.3 特征標(biāo)注

打標(biāo)簽是基因編輯的第一步

Ctrl+T（添加特征）：對(duì)片段進(jìn)行命名和注釋

片段并不存在方向

另存為，不要覆蓋原文件

4.1添加酶切位點(diǎn)：插入片段前的準(zhǔn)備

融合以上兩個(gè)片段即為軟件分子克隆的核心原理

三大要點(diǎn)：

位點(diǎn)正確

別接反了（方向性）

三字一組（防止移碼突變）

插入酶切位點(diǎn)

復(fù)制氨基酸序列，在開頭粘貼密碼子

左下角的不勾選就沒有標(biāo)注

命名：5‘端酶切位點(diǎn)名-片段名-3’端酶切位點(diǎn)名.dna

注意：不要誤以為，酶切位點(diǎn)長度一定是6bp，橫跨的氨基酸一定是3個(gè)

嚴(yán)守檢查規(guī)則，準(zhǔn)沒錯(cuò)

先選兩個(gè)酶切位點(diǎn)

限制性克隆>插入片段

點(diǎn)擊insert

按shift選兩個(gè)酶切位點(diǎn)就行

點(diǎn)擊product合成預(yù)覽

右下角命名：[片段名]-質(zhì)粒名.dna

直接保存

插入單一片段：非實(shí)用，但必須,無法使用

插入多片段：實(shí)用作業(yè)

表面展示的價(jià)值：

低成本富集

減少純化損傷

延長酶使用壽命

Police與Thief可以通過脫水方法聯(lián)系在一起

重點(diǎn)：注意順序

項(xiàng)目意義：

對(duì)于體外酶催化系統(tǒng)而言，采用溫和方法提取和保護(hù)酶幾乎是生命線

作業(yè)：

G4Slinker：4個(gè)甘氨酸（找密碼子）+1個(gè)絲氨酸（密碼子），就是15個(gè)堿基

5.1尋址游戲

模擬PCR和擴(kuò)增基本沒有關(guān)系

尋找目標(biāo)基因片段

絕大多數(shù)生物學(xué)論文不給序列，只發(fā)引物

模擬PCR的例題

primer>add primer

史上最大的蛋白質(zhì)只有25000個(gè)氨基酸

action PCR（CTRL+D）

命名：Amplified-片段名