2021年11月，山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院張振魯團隊在Molecular Plant Pathology(IF:5.663)發(fā)表了題為“Nitrate-inducible MdBT2 acts as a restriction factor to limit apple necrotic mosaic virus genome replication in Malus domestica”的研究論文，報道了MdBT2蛋白在抑制病毒ApNMV基因組RNA復制中的作用。

文章中所用酵母文庫為歐易生物構(gòu)建。

?研究背景?

先來認識一下蘋果和蘋果花葉病↓

（蘋果誰不認識，你是來搞笑的嗎？）?

蘋果花葉病中-重度表現(xiàn)（再嚴重會落葉，降低蘋果產(chǎn)量和質(zhì)量）↓↓↓

且植物病毒病像癌癥，無法根除，不過在植株健壯時，不會表現(xiàn)出來。

導致蘋果花葉病的病毒，之前一直被認為是蘋果花葉病毒（ApMV），近來發(fā)現(xiàn)，蘋果壞死花葉病毒（ApNMY）與此病更相關(guān)，然額，關(guān)于該病毒的研究較少，表現(xiàn)為↓

好在，文章中進行了介紹↓

ApNMV與ApMV相似，含有3種正義單鏈基因組RNAs：RNA1（編碼1a蛋白，后面你會經(jīng)?？吹剿?，對病毒復制至關(guān)重要），RNA2（編碼RNA聚合酶）和RNA3（編碼MP），以及在3種RNA中排名第4的RNA4（編碼CP）。

當然蘋果如何抵抗ApNMV的研究機制就更少了，背景先講這么多。

? 研究內(nèi)容??

5個問題，帶你get植物VS病毒的研究思路、方法

一、硝酸鹽處理對感病植株中ApNMV的RNA復制有啥影響？

實驗技術(shù)：

1.構(gòu)建病毒克隆，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，侵染不同濃度硝酸鹽處理過的蘋果植株，

2.測定被侵染的蘋果葉片中病毒RNA含量（Northern blot，RT-qPCR）。

實驗結(jié)果：高濃度硝酸鹽抑制ApNMY病毒的基因組RNA復制（如圖1）。

Fig1 (b) Northern blotting result. (c)RT-qPCR result.

二、硝酸鹽處理對感病植株中1a蛋白含量的影響，如何影響？

實驗技術(shù)：

1.（有啥影響）測定上述樣本中病毒1a蛋白含量（western blot）,

2.（如何影響）增加葉片處理方式，查找病毒1a含量變化原因：在硝酸鹽處理葉片前，先使用蛋白酶抑制劑MG132和DMSO對葉片進行預處理，同樣測定被侵染的蘋果葉片中病毒1a蛋白含量（western blot）。

實驗結(jié)果：硝酸鹽處理通過UPS途徑使病毒1a蛋白降解（如圖2）。

Fig2 Nitrate treatment destabilizes viral protein 1a through the UPS pathways.

三、病毒1a在蘋果中遇到了什么?

（即植物抵御病毒的機制研究開始了,

又即為什么用MdBT2作為研究中心和文章標題,

又又即酵母雙雜交是用在這兒呀）

實驗技術(shù)：

1.以病毒1a蛋白為誘餌，篩選蘋果酵母cDNA文庫（Y2H?screen）, 獲得了候選互作蛋白MdBT2，

2.體內(nèi)互作驗證（Y2H assay）,

3.對蛋白分段，進行互作的功能域研究（Y2H assay），

4.體外及煙草內(nèi)互作驗證（GST pull down、BiFC、熒光素酶互補驗證）。

實驗結(jié)果：ApNMV 1a與MdBT2互作（如圖3）。

Fig3 MdBT2 interacts with ApNMV 1a in vivo and in vitro.

四、MdBT2促進ApNMV 1a的泛素化和降解

（回答文章標題：MdBT2抑制病毒RNA積累原因1）

背景補充：

關(guān)于泛素化

（認識一下：泛素本素）

蛋白被泛素化后（即蛋白上結(jié)合了泛素），意味著將要被運往蛋白酶體降解，一般用于降解細胞內(nèi)老弱病殘蛋白，再回收利用。同時也被用于排除異己，抵御外敵。該過程需要一系列酶介導：泛素激活酶（E1）、泛素偶聯(lián)酶（E2）和泛素E3連接酶（E3）。其中E3是起特異性識別作用的，即決定誰該被降解，不能把好同志降解掉。所以E3基因很多，植物中主要有四種類型：HECT、RING、U-box和CRLs。其中CRLs是植物中含量最豐富的E3連接酶。

本研究中，通過酵母雙雜交篩選到的標題蛋白MdBT2，整好是CRLs亞家族之一。因此作者推測MdBT2可能在與ApNMV 1a結(jié)合后，起到了促進其泛素化和降解的作用。

（互作后，消滅你）

實驗技術(shù)：

1.構(gòu)建MdBT2-OE和MdBT2-anti蘋果植株（植物突變株構(gòu)建）,

2.體外檢測：使用MdBT2-GFP代替泛素化系統(tǒng)中的E3組分，進行1a-His的泛素化檢測（Ubiquitination assays），

3.體內(nèi)檢測：向WT、MdBT2-OE和MdBT2-anti蘋果植株中轉(zhuǎn)入pCXSN-1a-HA，MG132處理，測定被泛素化的Ubi（n）-1a-HA含量(IP、IB)，RT-qPCR測定RNA含量。

實驗結(jié)果：體內(nèi)外泛素化檢測結(jié)果顯示，MdBT2通過UPS途徑促進1a蛋白泛素化和降解(如圖4)。

Fig4 MdBT2 inhibits ApNMV genomic RNA replication by promoting the degradation and ubiquitination of viral protein 1a.

五、MdBT2 與2apol無互作，但干擾1a 和 2apol?之間的互作

（回答文章標題：MdBT2抑制病毒RNA積累原因2）

實驗技術(shù)：

1. MdBT2干擾1a 和 2apol?之間的互作(競爭性pull-down)，

2. MdBT2 與2apol無互作（Y2H assay，GST pull down）。

實驗結(jié)果：（略），感興趣同學看原文噢~

?思路總結(jié)?

>>?硝酸鹽處理后，感病植株病毒RNA含量、蛋白1a（病毒復制相關(guān)）含量下降，

>>?以1a為誘餌篩選蘋果文庫，發(fā)現(xiàn)E3家族中的MdBT2與之互作，

>>?通過體內(nèi)外泛素化實驗、發(fā)現(xiàn)MdBT2可以泛素化1a，

>>?測定MdBT2過表達及沉默表達的感病植株中1a和RNA含量變化，證實了文章標題。

? 研究結(jié)論??

硝酸鹽處理通過MdBT2介導的泛素-蛋白酶體途徑，破壞病毒復制蛋白1a的穩(wěn)定性，從而抑制ApNMV基因組RNA積累。該研究工作為將以MdBT2作為目標基因，通過遺傳育種技術(shù)，提高蘋果花葉病抗性提供了可能。

? 原文鏈接??

Http://doi.org/10.1111/mpp.13166

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END

海綿寶寶? 撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

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