膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最常見(jiàn)的世界衛(wèi)生組織 IV 級(jí)原發(fā)性腦癌，即使采用包括手術(shù)、放療和化療在內(nèi)的多模式治療，也幾乎無(wú)法治愈。研究表明，相當(dāng)比例的EGFR擴(kuò)增的GBM腫瘤有異常的MET表達(dá)，而激活的MET信號(hào)在繼發(fā)性GBM中更常見(jiàn)，這表明有必要對(duì)MET進(jìn)行深入研究。最近，越來(lái)越多的環(huán)狀RNA（circRNAs）已被證明在人類(lèi)癌癥中產(chǎn)生未被發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括GBM。在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）或N6-甲基腺苷（m6A）修飾的驅(qū)動(dòng)下，circRNAs可以編碼功能肽或蛋白質(zhì)，在自我更新、侵襲和治療耐藥性方面影響癌癥干細(xì)胞（CSCs）。

2023年7月25日，研究團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF=16.6)發(fā)表文章Circular RNA encoded MET variant promotes glioblastoma tumorigenesis。作者發(fā)現(xiàn)環(huán)狀MET RNA（circMET）編碼一個(gè)由N6-甲基腺苷（m6A）閱讀器YTHDF2促進(jìn)的404個(gè)氨基酸的MET變體（MET404）。circMET的基因消融可抑制小鼠中MET404的表達(dá)，并減弱MET信號(hào)傳導(dǎo)。MET404直接與MET β亞基相互作用，并形成一個(gè)組成性激活的MET受體，其活性不需要HGF刺激。MET404高表達(dá)預(yù)示GBM患者預(yù)后不良，提示其臨床相關(guān)性。文章揭示了circMET編碼一種蛋白MET404，并揭示了MET404驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制。

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院張弩教授、陸軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院病理研究所及西南腫瘤中心時(shí)雨副教授、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院白凡研究員、南京醫(yī)科大學(xué)汪秀星教授為共同通訊作者。中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院鐘鍵博士、WuXujia、GaoYixin、ChenJunju為共同第一作者。

circMET是m6A修飾的潛在編碼的circRNA

許多蛋白質(zhì)編碼的環(huán)狀RNA是由m6A修飾驅(qū)動(dòng)的。為了發(fā)現(xiàn)m6A修飾的環(huán)狀RNA，作者對(duì)10個(gè)GBM樣本進(jìn)行了RNA-seq和m6A-seq，結(jié)合核糖體RNA數(shù)據(jù)庫(kù)（Bowtie220）和參考基因組（HISAT221）分析，確定了剪接位點(diǎn)內(nèi)獨(dú)特的錨定位置。然后通過(guò)find_circ來(lái)識(shí)別環(huán)狀RNA，共鑒定出1425個(gè)m6A修飾的環(huán)狀RNA。另外，發(fā)現(xiàn)m6A修飾的環(huán)狀RNA更可能由單個(gè)外顯子產(chǎn)生，并且在癌組織中表達(dá)更高。KEGG富集分析也表明m6A修飾的環(huán)狀RNA的源基因在多種RTK通路中富集。

接下來(lái)作者為了揭示具有編碼潛力的環(huán)狀RNA，利用RNC-seq和find_circ鑒定了GSCs和對(duì)照神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs），共鑒定出共鑒定了1605個(gè)差異表達(dá)的RNC-circRNA。為了進(jìn)一步縮小GSCs中可翻譯的環(huán)狀RNA，將GSCs進(jìn)行RIP-seq，與上述m6A-seq和RNC-seq結(jié)果進(jìn)行交叉引用，鑒定出了5個(gè)候選的環(huán)狀RNA，作者考慮到MET在GBM腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，所以將重點(diǎn)放在circMET（hsa_circ_0082002）上進(jìn)行研究。

circMET由m6A閱讀器YTHDF2驅(qū)動(dòng)編碼MET404蛋白

circMET由hMET基因的第2外顯子形成，作者使用連接特異性引物驗(yàn)證了circMET（1214 nt），以及對(duì)RNase R消化的抗性。circMET包含一個(gè)跨物種保守的ORF，該蛋白在人類(lèi)和小鼠中編碼一個(gè)404個(gè)氨基酸（a.a.）蛋白。作者通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成circMET敲除（KO）小鼠，并顯著降低了circMET水平。在circMET KO小鼠多個(gè)器官中MET404表達(dá)顯著減少，而MET表達(dá)未受影響，表明circMET編碼了MET404蛋白。

circMET是一種m6A修飾的、YTHDF2相關(guān)的circRNA，YTHDF2是一種有效的GBM高表達(dá)的膠質(zhì)瘤預(yù)后標(biāo)志物。所以作者研究YTHDF2對(duì)circMET的翻譯是否影響，在GSC細(xì)胞中敲除了（KD）YTHDF2，發(fā)現(xiàn)YTHDF2 KD不影響circMET的表達(dá)，但降低了MET404蛋白水平。此外，通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)表明，YTHDF2突變體W432A和W486A不能與circMET相互作用，因此沒(méi)有改變MET404蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，與MET相比，MET404在一些GSCs和GBM癌組織中表達(dá)水平相當(dāng)甚至更高。GBM樣本的免疫組化（IHC）顯示，MET404表達(dá)與YTHDF2表達(dá)存在空間相關(guān)性，MET404高表達(dá)預(yù)示GBM患者總生存率較差。

MET404通過(guò)激活MET信號(hào)通路促進(jìn)GBM腫瘤的發(fā)生

為了探索MET404的未知功能，作者通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)或敲低circMET的GSC28細(xì)胞的RNA-seq，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)MET404參與了多種癌變信號(hào)通路。接著作者檢測(cè)了相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的circMET KD GSC456和GSC23細(xì)胞中，p-MET及其下游p-AKT，p-ERK顯著抑制；細(xì)胞增殖、有限稀釋試驗(yàn)和神經(jīng)球形成能力試驗(yàn)顯示，兩種類(lèi)型的circMET KD GSCs均受到抑制；而在GSC28細(xì)胞中，呈現(xiàn)相反的結(jié)果。

作者在小鼠上進(jìn)行了驗(yàn)證，MET404的KD抑制了小鼠腦腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)了總體生存期。了解到MET404激活的p-AKT可以模擬PTENf/-，作者構(gòu)建了P53f/f；R26-MET404-flagLSL/+；GFAP-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（MET404 KI小鼠）。大多數(shù)MET404 KI小鼠在20周時(shí)發(fā)生了腦腫瘤，腫瘤表型與GBM非常相似，具有高度激活的MET信號(hào)。與對(duì)照組小鼠（P53f/f；R26-MET404-flag+/+；GFAP-Cre，MST 48.35周，常死于皮下腫瘤）相比，MET404 KI小鼠的總生存期明顯較短（MST 29.25周，均死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤）。以上結(jié)果表明，MET404通過(guò)激活MET信號(hào)通路對(duì)GBM腫瘤發(fā)生至關(guān)重要。

MET404通過(guò)與METβ亞基相互作用來(lái)激活MET受體

作者對(duì)MET404激活MET信號(hào)通路的機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MET404能被分泌到GSC培養(yǎng)基中，并且純化后的MET404能激活MET和下游信號(hào)傳導(dǎo)，這些效應(yīng)可以通過(guò)添加MET404中和抗體來(lái)拮抗。在GSC28和GSC387細(xì)胞中，MET受體的穩(wěn)定KD抑制了純化的MET404誘導(dǎo)的MET的激活和下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。上述結(jié)果表明，MET404通過(guò)MET受體發(fā)揮作用。

接著作者通過(guò)IP-MS實(shí)驗(yàn)、分析及Reactome通路分析顯示，MET404相互作用蛋白與RTK、MET信號(hào)通路高度相關(guān)。然后利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，建立蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)IP和IF驗(yàn)證了GSC23細(xì)胞中MET404/MET的相互作用。上述結(jié)果表明，MET404是一種與MET相互作用的分泌蛋白。

為了闡明MET404/MET受體結(jié)合位點(diǎn)，作者首先使用ClusPro服務(wù)器模擬了由MET404和MET外域形成的復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)MET上的542-650殘基（跨越MET39的PSI和IPT1結(jié)構(gòu)域）是介導(dǎo)其與MET404相互作用的關(guān)鍵。由此合成了全長(zhǎng)MET受體和構(gòu)建了幾個(gè)截?cái)嗟腗ET受體結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)MET404與MET受體的PSI+ IPT1結(jié)構(gòu)域相互作用，并且MET404和HGF聯(lián)合處理對(duì)p-MET的活化有協(xié)同作用，但MET404比HGF的優(yōu)先級(jí)更高。

緊接著作者發(fā)現(xiàn)MET404可以在不需要HGF的情況下獨(dú)立激活p-MET，而RTK的激活需要在配體結(jié)合時(shí)發(fā)生二聚反應(yīng)。由此進(jìn)一步通過(guò)HA或標(biāo)記MET單體，并使用相應(yīng)的標(biāo)記抗體進(jìn)行COIP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組細(xì)胞中觀察到不同標(biāo)記的MET之間的相互作用（表明二聚體），并能通過(guò)添加純化的MET404得到加強(qiáng)。綜上所述，HGF和MET404獨(dú)立激活MET受體，并協(xié)同作用以最大限度地傳遞MET信號(hào)。

靶向MET404和奧納妥珠單抗抑制GBM進(jìn)展的協(xié)同作用

在GBM臨床樣本中，作者通過(guò)IF觀察到明顯的MET404和p-MET共定位，并且MET404強(qiáng)度與p-MET水平相關(guān)。此外，p-MET水平與GBM中MET404表達(dá)的相關(guān)性強(qiáng)于與MET受體表達(dá)的相關(guān)性，即MET404是GBM中p-MET的主要激活因子。而MET-404抗體的劑量依賴(lài)性添加逐漸降低了GSC23和GSC456細(xì)胞中的p-MET水平，提示在GBM中靶向MET404的臨床潛力。MET404抗體和奧納妥珠單抗的聯(lián)合使用能夠最大限度地抑制了GBM進(jìn)展和體內(nèi)MET信號(hào)傳導(dǎo)，并延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)小鼠的總生存期。

總結(jié)

總的來(lái)說(shuō)，本文確定了GBM中一個(gè)由circMET生成的分子靶點(diǎn)MET404。作為一種先前未知的MET配體，MET404組成性地激活MET受體，刺激不依賴(lài)于HGF的下游效應(yīng)因子，并驅(qū)動(dòng)GBM的腫瘤發(fā)生。用單克隆抗體靶向MET404增強(qiáng)了抗HGF/MET治療的療效，凸顯了一種可轉(zhuǎn)化的腦惡性腫瘤關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)治療策略。

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https:/https://www.nature.com/articles/s41467-023-40212-1