單細(xì)胞文章再添新物種！近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所在FASEB Journal (IF: 5.834，Q1)期刊發(fā)表了題為“A single-cell transcriptomic atlas characterizes cell types and their molecular features in yak ovarian cortex”的論文，郭憲研究員為通訊作者、裴杰副研究員為一作，本文構(gòu)建了牦牛卵巢皮質(zhì)單細(xì)胞圖譜，并闡述了牦牛卵巢皮質(zhì)細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于理解適應(yīng)高原環(huán)境的生殖特征及其機(jī)制提供了重要依據(jù)。

基本信息

材料：牦牛卵巢皮質(zhì)

期刊：FASEB Journal

發(fā)表時(shí)間：2022年12月21日

研究內(nèi)容和目的

哺乳動(dòng)物卵巢通過產(chǎn)生性激素維持雌性的性特征，釋放成熟卵母細(xì)胞以供受精并維持妊娠。卵巢是生殖的重要器官，其正常的生物學(xué)功能決定了動(dòng)物的繁殖效率。卵巢的功能依賴于卵巢內(nèi)不同類型的細(xì)胞之間通過細(xì)胞衍生的生物分子之間的相互作用而進(jìn)行的交流。scRNA-seq已幫助多個(gè)物種探究其卵巢細(xì)胞特征，從而揭示其分子機(jī)制。牦牛作為唯一能適應(yīng)青藏高原惡劣氣候條件的牛類動(dòng)物，是當(dāng)?shù)厝嗣裆a(chǎn)、生活中最重要的物種，但其卵巢分子特征尚不清楚。因此，描繪牦牛卵巢內(nèi)的細(xì)胞分子圖譜和細(xì)胞通訊有助于理解其適應(yīng)高原環(huán)境的生殖特征及其機(jī)制。

內(nèi)容概述

因此本研究使用scRNA-seq來描繪牦牛卵巢皮質(zhì)中各種細(xì)胞類型的分子特征。通過細(xì)胞特異性表達(dá)基因鑒定出內(nèi)皮細(xì)胞、NK細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、卵母細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，使用不同細(xì)胞類型的差異基因及其功能富集，構(gòu)建了牦牛卵巢皮質(zhì)細(xì)胞圖譜，同時(shí)通過細(xì)胞通訊分析構(gòu)建卵巢皮質(zhì)細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)。此外，利用卵母細(xì)胞的差異基因以及富集分析，將卵母細(xì)胞細(xì)分為四種亞型，并進(jìn)行發(fā)育軌跡分析。結(jié)合牦牛卵巢皮質(zhì)的免疫熒光結(jié)果，確定FST和TOP2A可以作為卵母細(xì)胞的marker基因。

綜上所述，本文在細(xì)胞分子水平上揭示了牦牛卵巢皮質(zhì)的生物學(xué)特性，并通過牦牛卵巢皮質(zhì)的細(xì)胞通訊為雌性生殖生物學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

具體研究內(nèi)容解析

1.細(xì)胞分群及注釋

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)QC質(zhì)控后共11853細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析，通過PCA降維聚類將所有細(xì)胞分為17個(gè)細(xì)胞群，使用熱圖展示每個(gè)cluster的TOP 5 marker，并使用feactureplot展示9個(gè)重點(diǎn)差異基因（圖 1a-e）。經(jīng)過細(xì)胞類型鑒定分別鑒定出巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、卵母細(xì)胞8種細(xì)胞類型，通過熱圖展示TOP 6 marker基因，并使用feactureplot、小提琴圖及氣泡圖展示不同細(xì)胞類型的marker基因在不同細(xì)胞類型中的特異表達(dá)（圖2a-e）。

圖1|牦牛卵巢皮質(zhì)細(xì)胞群分析

圖2|牦牛卵巢皮質(zhì)細(xì)胞鑒定

2.不同細(xì)胞類型GO、KEGG功能富集?

針對(duì)不同細(xì)胞類型高表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析。不同細(xì)胞類型展示了不同的生物學(xué)功能，其中內(nèi)皮細(xì)胞主要參與血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、notch信號(hào)通路等，卵母細(xì)胞主要表達(dá)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變、DNA修復(fù)及染色體分離過程相關(guān)功能，顆粒細(xì)胞參與固醇、類固醇、糖皮質(zhì)激素、雌激素代謝和氧化還原過程等（圖 3a）。

上述GO富集結(jié)果表明不同類型的細(xì)胞參與各自的生物學(xué)過程，但是與其已知的生物學(xué)功能相符。KEGG富集與GO富集結(jié)果一致，同樣表明卵母細(xì)胞參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和細(xì)胞周期途徑，顆粒細(xì)胞參與類固醇生成、膽固醇代謝、類固醇激素生物合成和氧化磷酸化途徑等（圖 3b）。

圖3|牦牛卵巢皮質(zhì)細(xì)胞GO、KEGG富集分析

3.擬時(shí)序分析

為探究細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行擬時(shí)序分析，并使用熱圖展示了不同細(xì)胞代表性基因隨著分化的進(jìn)行表達(dá)量的變化（圖 4a）。不同基因的高表達(dá)表明在不同階段執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能。例如卵母細(xì)胞標(biāo)記基因CENPF在整個(gè)分化過程中得表達(dá)量逐漸下降。這里就要提到到一個(gè)知識(shí)點(diǎn)，卵子發(fā)生經(jīng)歷三個(gè)不同的發(fā)育階段：減數(shù)分裂開始，圍產(chǎn)期卵泡形成，成年卵母細(xì)胞生長和成熟。牦牛卵巢皮質(zhì)內(nèi)的卵母細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)或生長狀態(tài)。而CENPF參與調(diào)控DNA合成，從而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。綜上所述，CENPF可能參與了牦牛卵母細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期的調(diào)控，其功能在分化過程中逐漸減弱。

4.細(xì)胞通訊分析

為探究卵巢皮質(zhì)細(xì)胞間通訊關(guān)系，使用cellphoneDB對(duì)卵巢皮質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行通訊分析（圖 4b）。結(jié)果表明卵母細(xì)胞主要調(diào)控基質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，主要受內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和自身調(diào)控。卵母細(xì)胞產(chǎn)生大量的配體與基質(zhì)細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的受體相結(jié)合，說明卵母細(xì)胞主要調(diào)控這兩種細(xì)胞類型（圖 4c，d）。同樣卵母細(xì)胞產(chǎn)生相對(duì)較多的與內(nèi)皮細(xì)胞和自身配體相結(jié)合的受體，說明卵母細(xì)胞主要由內(nèi)皮細(xì)胞和自身調(diào)控（圖 4c，d）。

圖4|牦牛卵巢皮質(zhì)細(xì)胞間通訊

5.卵母細(xì)胞異質(zhì)性分析

卵母細(xì)胞在卵巢皮質(zhì)中占據(jù)重要作用，因此對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行研究。通過小提琴圖發(fā)現(xiàn)特征基因TOP2A、MIS18BP1、FST和INHA在卵母細(xì)胞中的表達(dá)水平高于其他細(xì)胞類型（圖 5a）。因此，將卵母細(xì)胞分為4個(gè)亞型，并使用氣泡圖和熱圖展示沒各亞型TOP 5得marker基因（圖 5b-e）。為研究卵母細(xì)胞得發(fā)育軌跡使用monocle2進(jìn)行擬時(shí)序分析，并使用熱圖分析其基因隨發(fā)育軌跡表達(dá)量的變化，不同基因表達(dá)趨勢不同（圖 5f，h）。其中INHA和FST的表達(dá)水平在發(fā)育初期上調(diào)，發(fā)育后期下調(diào)，GADD45A在發(fā)育中期相對(duì)上調(diào)，而RAMP2和TOP2A的表達(dá)在早期和中期保持中等，后期明顯升高（圖 5g）。

圖5|牦牛卵巢皮質(zhì)卵母細(xì)胞異質(zhì)性分析

6.HE和免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

目前單細(xì)胞文章如果想有一個(gè)更高的層次普遍需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，驗(yàn)證方式有很多本文的驗(yàn)證方式就可以為其他老師作為參考。本文使用HE和免疫熒光進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示卵母細(xì)胞位于卵巢皮質(zhì)原始卵泡中，每個(gè)卵母細(xì)胞在腔前卵泡中被少量顆粒細(xì)胞前體細(xì)胞包圍（圖 6a）。通過免疫熒光技術(shù)來確定scRNA-seq是否準(zhǔn)確地篩選了卵母細(xì)胞的特異性表達(dá)基因。如免疫熒光切片所示，卵母細(xì)胞的蛋白FST和TOP2A在原始卵泡中鑒定出，表明這兩種蛋白的表達(dá)都位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖 6b，c）。靜止?fàn)顟B(tài)卵母細(xì)胞中FST的表達(dá)水平高于生長狀態(tài)卵母細(xì)胞。綜上所述，免疫熒光結(jié)果與scRNA-seq結(jié)果保持一致，確定了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

圖6|牦牛卵巢皮質(zhì)HE染色及免疫熒光驗(yàn)證

總結(jié)

1.構(gòu)建了牦牛卵巢皮質(zhì)單細(xì)胞圖譜，并闡述了牦牛卵巢皮質(zhì)細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)；

2.確定FST和TOP2A可以作為卵母細(xì)胞的marker基因。

Pei J, Xiong L, Guo S, et al. A single‐cell transcriptomic atlas characterizes cell types and their molecular features in yak ovarian cortex[J]. The FASEB Journal, 2023, 37(1): e22718.

https://doi.org/10.1096/fj.202201176RR?