寫在前面

????????今天推薦的是由英國格拉斯哥大學獸醫(yī)醫(yī)學與生命科學學院團隊在2020年7月發(fā)表于EMBOReports（IF：8.210，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Helen Walden教授，研究表明FANCI和FANCD2的泛素化具有不同的功能，但為了促進和維持ID2-DNA結合而趨同。

研究背景

????????Fanconi貧血(FA)是一種罕見的遺傳性疾病，由FANC基因突變引起。FANC基因的產物參與DNA支架間交聯(lián)(ICL)的修復以及維持基因組穩(wěn)定性以應對復制應激。FA雖然在普通人群中相當罕見，但癌癥患者的FA途徑基因經(jīng)常發(fā)生改變。

????????FA途徑是DNA鏈間交聯(lián)修復的專用途徑，在其他形式的復制應激反應中也會被激活。FA途徑中的一個關鍵步驟是ID2復合物的兩個亞基(FANCI和FANCD2)在特定賴氨酸殘基上的單泛素化。然而，這些修飾的分子功能在近二十年來一直是未知的。另外，F(xiàn)ANCI和FANCD2上泛素的去除對FA途徑也是至關重要的，這個去泛素化步驟由USP1-UAF1復合物催化。有證據(jù)表明，F(xiàn)ANCI和FANCD2參與了其他蛋白質的招募，但其中泛素化作用的機制和結構細節(jié)仍然不明。

摘要部分

????????作者重建了不同泛素化狀態(tài)下的人類ID2復合體，并對每個狀態(tài)的DNA結合進行了表征。研究表明，F(xiàn)ANCD2的泛素化顯著地增強了ID2復合物與dsDNA的結合。作者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCD2的泛素化是通過促進復合物中大規(guī)模的構象變化來增加ID2對雙鏈DNA的親和力，由此產生的復合體形成一個次級ID2“臂”的接合面而包圍DNA。另一方面，F(xiàn)ANCI的泛素化在很大程度上保護了FANCD2上的泛素免受USP1-UAF1去泛素化功能的影響，而FANCI泛素的關鍵疏水殘基對這種保護很重要?？偠灾?，F(xiàn)ANCI和FANCD2的泛素化似乎具有不同的功能，但這兩種翻譯后修飾都是為了穩(wěn)定ID2復合物包圍DNA的這一構象。

研究內容

1.FANCD2的泛素化增強ID2-dsDNA結合? ?? ?

????????為探究FANCI和FANCD2的泛素化是否影響ID2-DNA結合，作者對人FANCI（IUb）和FANCD2（D2Ub）分別進行泛素化和純化。然后，作者重組了非泛素化的ID2復合體(I+D2)、ID2Ub復合體以及IUbD2Ub復合體。作者基于PIFE和EMSA兩種技術來評估雙鏈DNA與上述復合物的結合。結果發(fā)現(xiàn)，與未修飾的ID2相比，F(xiàn)ANCD2泛素化的ID2Ub與DNA的結合顯著增強。作者還觀察到，PIFE實驗中的ID2以及ID2Ub與DNA的結合對鹽濃度高度敏感，而EMSA測定的相應離解常數(shù)受鹽濃度變化的影響較小。? ? ?
????????實驗結果顯示，與ID2相比，ID2Ub的DNA結合親和力增強了約10倍，然而相似濃度的D2Ub作用下不能檢測到DNA的結合。這表明FANCD2上的泛素本身不足以使DNA結合，但可以增強ID2-DNA的相互作用。有趣的是，與ID2Ub相比，IUbD2Ub與dsDNA的結合親和力沒有明顯不同。

研究結論：實驗顯示ID2Ub和IUbD2Ub與dsDNA的結合能力相近，并且相對于ID2-DNA的結合增強，而D2Ub自身不與DNA結合。這些表明，F(xiàn)ANCD2泛素化有助于促進或穩(wěn)定ID2-DNA結合。

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2.FANCD2泛素化與形成二級ID2接合面有關

????????為了探究ID2Ub與DNA結合親和力增強的結構細節(jié)，作者以適度的分辨率測定了FANCD2泛素化的重組人ID2復合物的冷凍電鏡圖譜。圖譜結果顯示，ID2Ub和IUbD2Ub-dsDNA的總體形狀相似，均呈閉合的環(huán)狀，但與非泛素ID2不同，這暗示FANCD2泛素化后的構象發(fā)生了總體變化。進一步的分析表明，F(xiàn)ANCD2的C端“臂”發(fā)生了主要的移動，并與FANCI的C端“臂”形成新的接合面，從而使ID2復合體處于閉合構像。作者將這個接合面稱為“Arm ID2”接合面，該接合面的形成對于ID2-DNA結合構象的形成是必要的。

研究結論：ID2的閉合構象必須穩(wěn)定才能緊密結合DNA，而FANCD2的泛素化在這一過程起關鍵作用。

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3.Arm ID2接合面是增強ID2-dsDNA結合所必需的

????????分析發(fā)現(xiàn)，致病性的FANCIR1285Q突變的位點靠近Arm ID2接合面，因此作者假設這種突變可能通過減少ID2的閉合狀態(tài)而干擾ID2泛素化。作者首先檢查了這種突變是否會影響FANCI與DNA以及FANCD2的相互作用，以及是否影響FANCI的泛素化。作者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCI突變導致ID2復合物中FANCD2泛素化明顯減少。另外，最近發(fā)現(xiàn)FANCI R1285Q突變不僅導致了ID2復合物中FANCI和FANCD2泛素化減少，而且導致復合物更快的去泛素化。這種較慢的泛素化和較快的去泛素化可能解釋了在具有FANCIR1285Q突變的細胞中幾乎不存在泛素化的FANCD2/FANCI的原因。

????????實驗結果顯示，當FANCI突變?yōu)镕ANCIR1285Q時，ID2-DNA親和力沒有顯著降低，而當FANCD2泛素化時，ID2-DNA親和力并沒有顯著增強，這與野生型復合物的情況不同。這些表明，F(xiàn)ANCI R1285Q的突變并不直接改變ID2-dsDNA結合，而是限制了FANCD2泛素化和相關的DNA結合增強，這可能是通過中斷Arm ID2接合面來實現(xiàn)的。

研究結論：病理性的FANCI R1285Q突變可能是通過干擾ID2的閉合構象破壞ID2泛素化。

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4.FANCI泛素化保護ID2Ub復合物免受USP1-UAF1介導的去泛素化

????????FANCI泛素化不能進一步增強ID2-DNA的結合，作者假設其主要作用可能是保護FANCD2的泛素不受USP1-UAF1活性的影響。作者比較了USP1-UAF1在一段時間中催化D2Ub、ID2Ub和IUbD2Ub去泛素化的過程。結果發(fā)現(xiàn)，在低USP1-UAF1濃度的情況下，D2Ub和ID2Ub以相似的速率去泛素化，然而，IUbD2Ub幾乎完全抵抗了USP1-UAF1介導的去泛素化。作者還發(fā)現(xiàn)，在較高濃度的USP1-UAF1下，F(xiàn)ANCD2可被去泛素化，盡管速度比D2Ub和ID2Ub慢，后者在10分鐘內迅速地去泛素化。進一步的分析表明，F(xiàn)ANCI的泛素化可使USP1-UAF1對FANCD2的去泛素化減弱。??? ?

????????研究結果表明，在ID2Ub和IUbD2Ub的DNA復合物中，F(xiàn)ANCD2上的泛素受到保護，從而不受一般DUB活性的影響。這種保護的潛在解釋是FANCI可能通過與FANCD2的泛素發(fā)生相互作用來阻止DUB接近。FANCI上的泛素在IUbD2Ub-DNA復合物中也不受USP2、USP7和USP1-UAF1去泛素化功能的影響。

????????一系列的數(shù)據(jù)表明，泛素上的F4和I44疏水表面對于IUb介導保護D2Ub的功能非常重要，這可能通過與FANCD2的相互作用完成。事實上，在最近報道的IUbD2Ub-DNA結構中，與FANCI結合的泛素的I44位于FANCD2-泛素的接合面之內，而F4似乎沒有直接接觸FANCD2。

?研究結論：FANCD2和FANCI的泛素化作用促進形成一個穩(wěn)定的IUbD2Ub-DNA復合物，此復合物對去泛素化具有抗性。

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5.FANCD2和FANCI泛素化的聯(lián)合作用使ID2與DNA穩(wěn)定結合

????????前面的結果證明了ID2復合物上發(fā)生的兩個單泛素化事件具有不同功能。作者提出，DNA結合允許ID2達到閉合的ID2構象，在這種構象中形成了Arm ID2接合面。這種構象變化可能暴露了FANCD2的賴氨酸及其鄰近的酸性殘基，從而允許Ube2T的對接和隨后的FANCD2泛素化，從而達到穩(wěn)定的閉合狀態(tài)。作者發(fā)現(xiàn)，USP1-UAF1在細胞內的作用將使一部分ID2Ub去泛素化從而將ID2恢復到開放狀態(tài)，但FANCI的連續(xù)泛素化可以保護IUbD2Ub不受影響以確保大部分ID2處于封閉狀態(tài)。因此，F(xiàn)ANCD2泛素化似乎通過達到封閉狀態(tài)來增強ID2-DNA的結合，而FANCI泛素化則通過抑制USP1-UAF1介導的去泛素化來維持這種封閉狀態(tài)。另外，由于FANCI的K1285位于觀察到的ArmID2接合面附近，所以FANCI上的R1285Q突變可以通過抑制閉合的ID2狀態(tài)和隨后的泛素化事件來干擾該接合面行使功能。

????????作者的模型提出了一系列事件，首先需要FANCD2泛素化來實現(xiàn)向具有更高DNA親和力的ID2狀態(tài)的轉變，然后FANCI的泛素化繼續(xù)維持這種狀態(tài)。盡管作者不能排除體內存在IUbD2復合物的可能性，但這種復合物更可能是由IUbD2Ub去泛素化產生的。

研究結論：FANCD2泛素化可調節(jié)ID2-dsDNA的結合親和力，而FANCI泛素化則在很大程度上保護泛素化的ID2復合物免受去泛素化的影響。ID2復合體中的兩個亞基FANCI和FANCD2分別行使自己特定的功能，從而使該復合體能夠在閉合構象下緊緊地結合在DNA上。

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結論與討論

研究表明，ID2復合體的兩個亞基FANCI和FANCD2上特定的兩個單泛素化具有不同的功能。作者發(fā)現(xiàn)FANCD2泛素化可以增強ID2復合物與dsDNA的結合親和力，而FANCI泛素化則保護復合物免受USP1-UAF1介導的去泛素化作用。FANCI和FANCD2兩種功能的聯(lián)合作用使得在dsDNA上可以形成穩(wěn)定的ID2復合物。

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原文鏈接：

https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202050133