如約而見，甚是想念！歡迎大家來到單細(xì)胞蛋白組文獻(xiàn)分享系列第二期，此次為大家?guī)淼氖荕atthias Mann研究團(tuán)隊發(fā)表在Molecular aystems biology（IF=11.429）雜志上的名為“Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation”的文章，作者開發(fā)了一個強大的基于質(zhì)譜的高靈敏度工作流程T-SCP（true single-cell–derived proteomics），將微型樣品制備、極低流速色譜法和新型捕獲離子遷移率質(zhì)譜儀timsTOF SCP結(jié)合起來，從而使靈敏度提高了10倍以上，準(zhǔn)確且可靠地量化單個FACS分離細(xì)胞中的蛋白質(zhì)組及其變化，從而實現(xiàn)真正的單細(xì)胞蛋白組學(xué)。

蛋白質(zhì)組學(xué)是對細(xì)胞、組織、器官或有機體的蛋白質(zhì)進(jìn)行表征。然而，對于單細(xì)胞研究是有難度的，主要由于蛋白質(zhì)沒有類似DNA的PCR擴增的方法，因此，任何檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)都必須足夠敏感，這樣才能在細(xì)胞僅含有微量蛋白質(zhì)時還能識別它們。這篇文章對于單細(xì)胞蛋白組的實驗做了以下幾方面工作：

?一

探究初始LC-MS設(shè)置的靈敏度極限

首先，作者引入PASEF（parallel accumulation–serial fragmentation?又稱為并行累加–串行碎片，肽離子從捕獲離子遷移率（TIMS）裝置釋放到濃縮包裝的真空系統(tǒng)中）的質(zhì)譜采集方案，在TIMS qTOF儀器上通過數(shù)據(jù)依賴模式（ddaPASEF）或非數(shù)據(jù)依賴模式（diaPASEF）高敏碎片化手段，可以得到很高的離子利用率和數(shù)據(jù)完整性，其中通過dda采集模式和MaxQuant分析0.8 ng HeLa裂解物共鑒定出550種蛋白質(zhì)。考慮到單個HeLa細(xì)胞的蛋白質(zhì)量低至150 pg?，再加上樣品制備中不可避免的損失，550這個數(shù)字并非真正單細(xì)胞蛋白的結(jié)果，因此需要提高靈敏度才能實現(xiàn)真正的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)。

?二

構(gòu)建高靈敏度質(zhì)譜系統(tǒng)

決定MS靈敏度的三個主要因素是：電離效率，進(jìn)入真空系統(tǒng)的傳輸效率和儀器對離子的利用度。所以研究者進(jìn)行了以下幾方面的改進(jìn)：

（1）開發(fā)了一個較強的離子源，引入了全新的離子光學(xué)元件，優(yōu)化檢測器電壓等參數(shù)，之后將離子電流增加了4.7倍，構(gòu)造了一個具有較亮離子源的儀器。接下來對FACS方式分選的0,1和6個HeLa細(xì)胞分揀到不同的384孔中，分別進(jìn)行蛋白處理進(jìn)行檢測，分別識別出824、1364和1946種蛋白質(zhì)，結(jié)果表明與比較六個細(xì)胞相比，單細(xì)胞的定量準(zhǔn)確率沒有太大降低。

（2）研究人員發(fā)現(xiàn)通過把樣品負(fù)載和梯度形成與LC-MS運行分離，并以1 ul / min的標(biāo)準(zhǔn)流速運行，可以實現(xiàn)高重現(xiàn)性。系統(tǒng)流速由單個泵控制，流速降至25 nl / min時仍可以穩(wěn)定運行。（3）樣本制備方面，使用了用于PCR反應(yīng)的384孔板來為細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)消化提供通用、自動化的小體積環(huán)境。同時，比較正常的1 uL / min和100 nL / min流速下的殘留時間，發(fā)現(xiàn)降低流速導(dǎo)致信號增加了十倍。然后，結(jié)合極低流量色譜和diaPASEF模式，能從1ng樣本中對3900多種HeLa蛋白進(jìn)行鑒定和定量，具有高可重復(fù)性。

在此，作者利用基于MS的T-SCP技術(shù)和微量樣本處理系統(tǒng)，極低流量的色譜法和diaPASEF采集模式與之前的方法相比，識別的蛋白數(shù)量顯示出顯著的優(yōu)勢。

?三

方法驗證-T-SCP剖析被捕的細(xì)胞周期狀態(tài)

作者把單細(xì)胞水平上檢測出對藥物擾動的生物反應(yīng)作為T-SCP蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程的實際應(yīng)用場景，使用胸苷thymidine和nocodazol諾考達(dá)唑處理HeLa細(xì)胞后，刺激產(chǎn)生了四個在特定細(xì)胞周期階段富集的細(xì)胞群。通過前述方法，對每個單細(xì)胞的蛋白進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計，多可達(dá)2083個，共定量1305種蛋白，單細(xì)胞定量數(shù)高達(dá)到1209種。蛋白信號求和后，G1和G1 / S細(xì)胞，G2和G2 / M細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量均有所不同，T-SCP這個蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程正確地反映了增殖狀態(tài)，同時突出了每個細(xì)胞周期階段內(nèi)的異質(zhì)性顯著。

類似于scRNA-seq在細(xì)胞類型和狀態(tài)發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的應(yīng)用，研究者根據(jù)參考文獻(xiàn)篩選出了的G2 / M，G1和S期中差異顯著的20種蛋白作為標(biāo)記蛋白，建立細(xì)胞周期階段分類器，可以根據(jù)G2 / M階段評分對G2 / M和G1 / S進(jìn)行區(qū)分（AUC=0.895）。同時，對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和過濾后對蛋白進(jìn)行差異性表達(dá)分析，識別出了重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白。

?四

單細(xì)胞蛋白組與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異

接下來，研究者將單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)測量結(jié)果與scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平在scRNA-seq技術(shù)之間具有很好的相關(guān)性，但與單細(xì)胞蛋白質(zhì)測量值卻沒有相關(guān)性。這表明單細(xì)胞蛋白質(zhì)和RNA的水平有很大的不同，這意味著RNA和蛋白質(zhì)存在不同的調(diào)節(jié)機制，單純的RNA測序所獲得的信息是有限的。

?五

單細(xì)胞核心蛋白組

比較單細(xì)胞蛋白質(zhì)組測量和六細(xì)胞蛋白質(zhì)組結(jié)果顯示此方法可以鑒定大部分穩(wěn)定表達(dá)蛋白。低表達(dá)蛋白的CV服從泊松分布，但在高表達(dá)蛋白中CV顯著降低，這說明低水平表達(dá)蛋白的測量變異性受技術(shù)敏感性限制。

?

總結(jié)：

該方法可以容易地應(yīng)用于組織材料的高敏感性分析，以獲得的健康和疾病狀態(tài)的細(xì)胞異質(zhì)性，可以在樣本受限的情況下提高測定靈敏度，促進(jìn)了單細(xì)胞蛋白組學(xué)的發(fā)展。

DOI:10.15252/msb.202110798